БИОКАТАЛИЗАТОР, СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗО-ФРУКТОЗНЫХ СИРОПОВ Российский патент 2008 года по МПК C12P19/24 C12N11/04 

Изобретение относится к области биотехнологии и способам приготовления биокатализаторов, которые могут использоваться в реакциях биоконверсии природных субстратов, например в процессах получения сладких сиропов из возобновляемого крахмалосодержащего растительного сырья.

Известно, что сладкие сиропы - глюкозно-фруктозный, инвертный и другие, широко применяются в пищевой промышленности в качестве натуральных заменителей белого сахара при производстве безалкогольных напитков, кондитерских изделий и продуктов диетического питания, а также при консервировании. Использование этих сиропов в рецептурах приготовления различных изделий существенно улучшает их потребительские свойства, замедляет процессы высыхания и затвердевания (черствения).

Одним из путей проведения реакций биоконверсии природных субстратов является использование гетерогенных биокатализаторов, представляющих собой ферментативно-активную субстанцию (индивидуальный фермент или целую бактериальную клетку), иммобилизованную в инертную твердую или гелеобразную нерастворимую матрицу.

Усовершенствование состава биокатализаторов и разработка новых способов иммобилизации является актуальной задачей.

Известен способ иммобилизации бактериальных клеток актиномицетов Streptomyces albogriseolus 28-3, обладающих глюкозоизомеразной активностью и катализирующих ферментативную реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу, путем включения биомассы в нерастворимый носитель [SU 1731815, C12N 11/04, 07.05.1992.]. Для этого биомассу Streptomyces albogriseolus 28-3 смешивают с раствором хитозана. В полученную суспензию сначала добавляют раствор соли трехвалентного ацетата кобальта Co(III), который получают окислением двухвалентного кобальта Со(II) перекисью водорода. Затем в полученную смесь вводят по каплям водный раствор аммиака для формирования гранул биокатализатора. Активность биокатализатора составляет 190 мкмоль/мин/г влажного биокатализатора при 60°С. При иммобилизации бактериальные клетки сохраняют не более 66% от исходной активности в суспензии. Недостатками данного способа являются следующие: 1) в состав биокатализатора входит кобальт в неустойчивом трехвалентном состоянии, 2) при приготовлении биокатализатора используют агрессивные (перекись водорода) и сильно пахнущие (аммиак) реагенты.

Известен способ иммобилизации глюкозоизомеразы путем адсорбции на сополимере стирола и дивинилбензола, активированном хлорметилированием и обработанным триалкилфосфином и гидроксидом щелочного металла [пат. RU 2031124, С12Р 19/24, C12N 11/06, 20.03.1995]. Продолжительность стадии приготовления носителя и адсорбции составляют 19 ч и 5 ч, соответственно. При иммобилизации глюкозоизомераза сохраняет не более 69% от исходной активности фермента в растворе. Биокатализаторы теряют 30-50% начальной активности свежеприготовленного катализатора через 31 сут эксплуатации при 60°С. Максимальная продуктивность составляет 1,04 кг сухих веществ глюкозо-фруктозного сиропа с 1 г биокатализатора. Недостатками данного способа является использование органических полимеров, токсичных органических соединений, агрессивных реагентов (щелочь), а также многостадийность процесса иммобилизации (активация, обработка носителя, адсорбция фермента) и его большая продолжительность.

Наиболее близким является способ иммобилизации частично очищенного препарата глюкозоизомеразы из Actinomyces olivocinereus 154 на макропористых носителях на основе высушенных и прокаленных форм диоксида кремния (силикагелях и силохромах) путем ковалентного связывания с помощью γ-аминопропилтриэтоксисилана и глутарового диальдегида [Ворошилова О.И., Киселев А.В., Никитин Ю.С., Хохлова Т.Д., Ананичев А.И., Угоров A.M., Улезло И.В. Иммобилизация глюкозоизомеразы из Actinomyces olivocinereus 154 на макропористых кремнеземных носителях. //Прикладн. Биохим. Микробиол. 1984. Т.20. Вып.2. С.223-229]. Продолжительность стадий приготовления носителя и иммобилизации на нем фермента составляют не менее 2 ч и 6 ч, соответственно. Следует отметить, что поверхность высушенных и прокаленных форм диоксида кремния с уже сформированной текстурой носителя является достаточно инертной, и для иммобилизации ферментов требуется дополнительная активация поверхности γ-аминопропилтриэтоксисиланом, при помощи которого на поверхность вводятся аминогруппы, а также использование бифункциональных сшивающих реагентов таких как глутаровый диальдегид. При иммобилизации глюкозоизомераза сохраняет 10-40% от исходной активности фермента в растворе. Биокатализатор на основе иммобилизованной глюкозоизомеразы сохраняет 75% начальной активности свежеприготовленного образца через 40 ч работы при 70°С.

Существенными недостатками данного способа являются следующие: 1) использование токсичных сшивающих реагентов (глутарового диальдегида), приводящих к потере ферментативной активности, 2) низкая ферментативная активность биокатализатора, составляющая 5,3 мкмоль/мин/г биокатализатора при 60°С; 3) потеря при иммобилизации 60-90% от исходной активности фермента в растворе, 4) применение для приготовления биокатализатора очищенного фермента, что приводит к существенному удорожанию ферментного препарата с глюкозоизомеразной активностью из-за наличия стадий выделения и очистки, 5) сравнительно большая продолжительность процесса иммобилизации (не менее 8 ч).

Изобретение решает задачу разработки эффективного способа получения глюкозо-фруктозных сиропов.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в ускорении и упрощении процесса иммобилизации бактериальных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью (БКГИА), а также в сохранении на высоком уровне ферментативной активности клеток после иммобилизации.

Задача решается использованием биокатализатора - иммобилизованных БКГИА, в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы. Биокатализатор содержит биомассу, диоксид кремния, используемый в виде гидрогеля; при этом соотношение основных компонентов биокатализатора - биомассы бактериальных клеток и диоксида кремния, составляет от 1:6 до 1:10 в весовых частях по сухим веществам. Биокатализатор дополнительно содержит соединения магния и двухвалентного кобальта, которые используются для активации и стабилизации внутриклеточного фермента глюкозоизомеразы.

В качестве БКГИА используют биомассу бактерий в виде пасты с влажностью 75-80%.

Диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажностью 60-95%, величиной удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равной 30-550 м²/г, насыпной плотностью продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равной 0.1-0.7 г/см³.

В качестве дополнительных компонентов биокатализатора используют растворимые соли магния Mg (II) и двухвалентного кобальта Со (II) в виде сульфатов, или нитратов, или хлоридов, в количестве 1-1.2 мкмоль на 1 г сухого биокатализатора.

Биокатализатор имеет величину удельной поверхности 50-300 м²/г, объем пор 0.3-1.0 см³ и диаметр пор 10-15 нм.

Задача решается также способом приготовления биокатализатора для получения глюкозо-фруктозных сиропов, по которому иммобилизацию бактериальных клеток с глюкозоизомеразной активностью в диоксид кремния проводят путем смешения биомассы бактериальных клеток в виде влажной пасты, диоксида кремния в виде гидрогеля, и солей магния и двухвалентного кобальта в виде водных растворов солей (сульфатов, или нитратов, или хлоридов), с последующей сушкой полученной смеси на воздухе при температуре 50-70°С в течение не более 2 ч, прессованием и грануляцией в частицы размером 0.4-3.0 мм.

Диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажностью 60-95%, величиной удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равной 30-550 м²/г, насыпной плотностью продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равной 0.1-0.7 г/см³.

Гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия или калия с минеральной кислотой, выбранной из ряда - серная, азотная или угольная, или путем взаимодействия с аммонийными солями серной, или азотной, или угольной кислот, при значении рН 6.5-9, температуре 20-90°С, скорости осаждения 30-300 г SiO₂/л_сусп/ч с последующей отмывкой и фильтрацией гидрогеля.

Задача решается также способом получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, в котором используют описанный выше биокатализатор. Процесс проводят в реакторе с неподвижным слоем при температуре 60-70°С и при скорости потока реакционной среды, содержащей глюкозу или фруктозу, через слой биокатализатора, равной 0.02-0.04 л/ч. Биокатализатор используют в виде частиц размером 0.4-3.0 мм.

Технический результат достигается вследствие реализации следующих групп отличительных признаков: 1) оптимизацией состава биокатализатора, 2) методом приготовления биокатализатора путем смешения биомассы БКГИА с диоксидом кремния в виде гидрогеля, а не в виде сформировавшего текстуру высушенного и прокаленного диоксида кремния (силикагеля), 3) методом получения гидрогеля диоксида кремния, обеспечивающим набор заявляемых свойств, 4) определенным набором свойств гидрогеля диоксида кремния и готового биокатализатора с глюкозоизомеразной активностью, 5) методом проведения каталитической реакции изомеризации моносахаридов (глюкозы или фруктозы). Следует отметить, что использование диоксида кремния в виде гидрогеля, а не силикагеля приводит к равномерному распределению всех компонентов в объеме биокатализатора, обеспечивает прочное закрепление и отсутствие вымывания БКГИА. Метод приготовления биокатализатора отличается меньшим по сравнению с прототипом количеством стадий, а также сравнительной простотой и доступностью всех компонентов биокатализатора.

Биокатализатор для изомеризации глюкозы имеет следующий состав по основным компонентам: бактериальные клетки, обладающие глюкозоизомеразной активностью (БКГИА), - 1 весовая часть, и диоксид кремния в виде гидрогеля - от 6 до 10 весовых частей по сухому веществу. Гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия или калия с минеральной кислотой, выбранной из ряда - серная, или азотная, или угольная, или путем взаимодействия с аммонийными солями серной, или азотной, или угольной кислот, при значении рН 7-9, температуре 20-90°С, скорости осаждения 30-300 г SiO₂/л_сусп/ч с последующей отмывкой и фильтрацией гидрогеля. Полученный в заявляемых условиях гидрогель имеет следующий набор свойств: влажность гидрогеля 60-95%, величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, составляет 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, составляет 0.1-0.7 г/см³. Гидрогель диоксида кремния инертен, отличается высокой химической и микробиологической устойчивостью. Дополнительными компонентами биокатализатора являются Mg(II) и Со(II) в виде растворимых солей серной, или, азотной, или соляной кислот в количестве 1-1,2 мкмоль на 1 г сухого биокатализатора. Как отмечалось выше, присутствие двухвалентных ионов магния и кобальта является необходимым, так как ионы этих металлов значительно увеличивают термостабильность внутриклеточной глюкозоизомеразы при термообработке биомассы при 50-70°С.

Биокатализатор изомеризации глюкозы готовят путем тщательного смешения БКГИА, гидрогеля диоксида кремния и растворимых солей Mg(II) и Со(II) до однородной массы. Затем полученную смесь высушивают при температуре 50-70°С. Высушивание смеси при температуре ниже 50°С существенно увеличивает продолжительность сушки и приготовления биокатализатора, тогда как высушивание смеси при температуре выше 70°С приводит к потере ферментативной активности. Высушенную смесь прессуют при давлении 150 атм и механически измельчают до частиц размером 0.4-3.0 мм. В результате получают гранулированный твердый биокатализатор, обладающий глюкозоизомеразной активностью, превышающей 20 мкмоль/мин/г сухого биокатализатора (в прототипе 5.3 мкмоль/мин/г). Как отмечалось выше, для его приготовления используют бактериальные клетки без предварительного выделения и очистки индивидуального фермента (в отличие от прототипа). Заявляемый состав, способ приготовления и свойства используемого гидрогеля диоксида кремния обеспечивают высокую активность и стабильность биокатализатора. Так, при иммобилизации предложенным способом сохраняется более 70% от исходной активности клеток в суспензии (в прототипе - 10-40%). Продолжительность процесса иммобилизации и приготовления биокатализатора для изомеризации глюкозы не превышает 4 ч (в прототипе - более 8 ч).

Биокатализатор обладает следующим набором свойств. Удельная поверхность биокатализатора после высушивания при 50-70°С составляет 50-300 м²/г. По данным ртутной порометрии средний размер пор составляет 10-15 нм, то есть биокатализатор имеет мезопористую структуру. Мезопористая структура биокатализатора обеспечивает его работу в кинетической области без диффузионного торможения в реакции изомеризации глюкозы или фруктозы. Глюкозоизомеразная активность биокатализатора составляет не менее 20 мкмоль/мин/г сухого биокатализатора. Обнаружено, что гидрогель диоксида кремния проявляет защитное действие, и при включении бактериальных клеток в гидрогель существенно увеличивается термостабильность внутриклеточной глюкозоизомеразы. Например, бактериальные клетки актиномицетов, высушенные при 70°С без гидрогеля, сохраняют 44% от исходной активности клеток в суспензии, тогда как бактериальные клетки в биокатализаторе (с гидрогелем) - 74%. Биокатализатор устойчив в реакционной среде - буферном растворе со значением рН 7.8 и обладает сравнительно высокой механической прочностью, позволяющей применять его в реакторе с неподвижным слоем

Таким образом, существенными отличительными признаками заявляемого биокатализатора и способа его приготовления, по сравнению с прототипом, являются следующие: 1) использование для приготовления биокатализатора метода включения (а не ковалентного связывания) и инертных веществ (гидрогеля диоксида кремния), 2) более высокая глюкозоизомеразная активность биокатализатора (в 5 раз выше), чем в прототипе, 3) более высокий уровень сохранения исходной ферментативной активности клеток при иммобилизации, 4) применение для приготовления биокатализатора целых бактериальных клеток без предварительного выделения и очистки индивидуального фермента, 5) существенное ускорение (не менее чем в 2 раза) и упрощение процесса иммобилизации и приготовления биокатализатора.

Заявляемый набор свойств биокатализатора (состав, способ приготовления, ферментативная активность) обеспечивают высокую эффективность работы данного биокатализатора в реакции изомеризации глюкозы или фруктозы в глюкозо-фруктозные сиропы в проточных реакторах различного типа, в том числе с неподвижным слоем биокатализатора.

Для характеризации гидрогеля диоксида кремния и готового биокатализатора используют следующие физико-химические методы.

Весовым (гравиметрическим) методом по потере веса после сушки гидрогеля диоксида кремния при 105-120°С в течение 12 ч определяют влажность гидрогеля (W, вес.%). Методом БЭТ по тепловой десорбции аргона определяют величину удельной поверхности (S_уд, м²/г) высушенного гидрогеля диоксида кремния и готового биокатализатора. Весовым методом определяют насыпной вес высушенного гидрогеля диоксида кремния. Методом ртутной порометрии определяют объем (V_пор, см³/г) и диаметр пор (D_пор, нм) готового биокатализатора.

Биокаталитическую активность БКГИА определяют по скорости превращения (в мкмоль/мин) моносахарида (глюкозы или фруктозы) в глюкозо-фруктозный сироп в 0.02 М фосфатном буфере рН 7.8 при температуре реакции 60-70°С. Состав реакционной среды следующий: начальная концентрация моносахарида - 1.9-2.1 М (42-46% по сухим веществам); концентрациях ионов магния Mg (II) - 1 мМ; концентрациях кобальта Со (II) - 1 мМ. Удельную активность бактериальных клеток в суспензии и в иммобилизованном состоянии выражают в мкмоль/мин/г сухих клеток

Биокаталитическую активность приготовленных биокатализаторов определяют в аналогичных условиях - в 0.02 М фосфатном буфере рН 7.8 при температуре реакции 60-70°С. В проточный колоночный реактор загружают биокатализатор с размером гранул 0.4-3.0 мм в количестве 1 г и через неподвижный слой биокатализатора многократно прокачивают (циркулируют) реакционную среду объемом 10 мл описанного выше состава. Объемную скорость потока варьируют от 0.018 л/час до 0.42 л/ч. Активность биокатализатора выражают мкмоль/мин/г сухого биокатализатора.

Операционную стабильность биокатализатора оценивают по времени полуинактивации биокатализатора (t¹/₂). Активность определяют в реакции изомеризации 2 М фруктозы в 0.02 М фосфатном буфере рН 7.8 при температуре реакции 70°С. Один реакционный цикл продолжается в течение 2 ч, затем биокатализатор промывают буферным раствором рН 7.8 и хранят в этом буферном растворе при 20-22°С. Аналогичным образом измеряют активность биокатализатора в следующих реакционных циклах. Время полуинактивации соответствует времени, при котором отношение величины активности в реакционном цикле (А_i) к начальной активности (А_о) свежеприготовленного биокатализатора составляет 0.5.

Условия получения и свойства используемых гидрогелей диоксида кремния приведены в таблице 1.

Таблица 1Условия получения и свойства гидрогелей диоксида кремнияШифр образцаУсловия получения гидрогеляСвойства гидрогеляСиликатОсадительT_осаж °CpH_осажСкорость осаждения, г/л/чВлажность W, %S_уд, м²/гНас. вес, г/см³I NH₄NO₃707.5300905500.1IINa₂SiO₃NH₄НСО₃706.5270955000.1III (NH₄)₂SO₄707.5270883500.12IVK₂SiO₃(NH₄)₂SO₄207.5150801500.30VNa₂SiO₃Н₂СО₃707.0270803500.20VIHNO₃507.0200853000.35VIIH₂SO₄209.03060300.70

Свойства катализаторов в зависимости от состава биокатализаторов, способа их приготовления приведены в таблице 2.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление биокатализатора

В качестве биомассы бактериальных клеток с глюкозоизомеразной активностью (БКГИА) используют жизнеспособные нерастущих клетки актиномицета Arthrobacter nicotianae, выращенные на сахарозе и собранные в стационарной фазе роста путем центрифугирования при 3-5 тыс.об/мин. Биомасса представляет собой пасту желтого цвета с влажностью 75-80% и обладает ферментативной активностью в реакции изомеризации глюкозы или фруктозы, равной 300-500 мкмоль/мин/г сухих клеток.

Для приготовления биокатализатора используют биомассу с удельной глюкозоизомеразной активностью 270 мкмоль/мин/г сухих клеток.

Гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия с нитратом аммония при температуре 70°С, рН 7.5, скорости осаждения 300 г SiO₂ /л/ч (образец под шифром I в таблице 1).

Иммобилизацию БКГИА и приготовление биокатализатора осуществляют следующим образом. 0.5 г влажной биомассы, 10.0 г влажного гидрогеля диоксида кремния, 0.05 мл раствора 0.2 М сульфата магния и 0.05 мл раствора 0.2 М сульфата кобальта тщательно перемешивают до однородной смеси. Аналогичные результаты получаются при использовании солей магния (II) и кобальта (II) в виде нитратов, или хлоридов. Затем полученную смесь высушивают при 70°С в течение 2 ч. Высушенную смесь прессуют при избыточном давлении 150 атм. Таблетки, полученные после прессования, механически размельчают и отсеивают фракции определенного гранулометрического состава на соответствующих ситах. Массовое соотношение основных компонентов (БКГИА и гидрогеля диоксида кремния) по сухим веществам составляет 1:10. Биокатализатор характеризуется следующим набором параметров: величина удельной поверхности 290 м²/г, объем пор 0.7 см³ и средний диаметр пор 10 нм.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0.4-3.0 мм равна 18 мкмоль/мин/г. Удельная активность иммобилизованных бактериальных клеток составляет 190 мкмоль/мин/ г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется 70% от исходной активности бактериальных клеток в суспензии. Стабильность такова, что биокатализатор сохраняет 50% первоначальной активности после 22 ч работы биокатализатора при 70°С (t¹/₂=22 ч).

Примеры 2, 3, 4. Приготовление биокатализатора

Аналогичны примеру 1, отличаются тем, что используют гидрогели диоксида кремния, описанные в таблице 1 под шифрами III, IV, VI.

Получаемые биокатализаторы аналогичны биокатализатору по примеру 1 (таблица 2).

Пример 5. Приготовление биокатализатора

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что используют гидрогель диоксида кремния, описанный в таблице 1 под шифрами VII.

Полученный биокатализатор отличается от биокатализатора по примеру 1 более низкой удельной поверхностью и объемом пор, а также большим размером пор (таблица 2).

Пример 6. Приготовление биокатализатора

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что массовое соотношение основных компонентов (БКГИА и гидрогеля диоксида кремния) по сухим веществам составляет 1:6.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0.5-2 мм равна 25 мкмоль/мин/г. Удельная ферментативная активность иммобилизованных бактериальных клеток составляет 200 мкмоль/мин/г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется 74% от исходной активности бактериальных клеток в суспензии. Стабильность биокатализатора такова, что биокатализатор сохраняет 50% первоначальной активности после 20 ч работы биокатализатора при 70°С (t¹/₂=20 ч).

Пример 7. Приготовление биокатализатора

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что массовое соотношение основных компонентов (БКГИА и гидрогеля диоксида кремния) по сухим веществам 1:5. Удельная исходная активность бактериальных клеток в суспензии составляет 470 мкмоль/мин/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0.4-3.0 мм не зависит от размера гранул и составляет 61 мкмоль/мин/г. Удельная ферментативная активность иммобилизованных бактериальных клеток составляет 300 мкмоль/мин/г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется 64% от исходной активности бактериальных клеток в суспензии. Однако из-за высокого содержания БКГИА приготовленный биокатализатор в отличие от биокатализаторов по примерам 1-6 отличается низкой устойчивостью в реакционной среде. Вероятно, высокое содержание бактериальных клеток препятствует формированию текстуры диоксида кремния, и биокатализатор быстро разрушается в реакционной среде. Стабильность биокатализатора из-за низкой устойчивости не определена.

Пример 8. Приготовление биокатализатора

Аналогичен примеру 7, отличается тем, что продолжительность сушки при 70°С составляет 4 ч.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул биокатализатора 0.4-0.5 мм составляет 21 мкмоль/мин/г. Удельная ферментативная активность иммобилизованных бактериальных клеток составляет 100 мкмоль/мин/ г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется 20% от исходной активности интактных клеток в суспензии. Биокатализатор отличается сравнительно низкой активностью (по сравнению с примерами 1-5) из-за более продолжительной сушки, в результате которой наблюдается термоинактивация внутриклеточной глюкозоизомеразы.

Пример.9. Приготовление биокатализатора

Аналогичен Примеру 1, только для приготовления биокатализатора в качестве БКГИА используют биомассу рекомбинантного штамма-продуцента, полученного методами генетической инженерии на основе Escherichia coli K12.

Активность приготовленного биокатализатора равна 0.2 мкмоль/мин/г. Удельная ферментативная активность составляет 70 мкмоль/мин/г сухих клеток, то есть при иммобилизации сохраняется ˜2% от исходной активности клеток в суспензии. Биокатализатор сохраняет начальную активность в течение 6-8 час работы в условиях непрерывного процесса изомеризации фруктозы при 35°С, затем активность резко падает. Обнаружено, что при хранении 20-22°С в буферном растворе рН 7.8 активность биокатализатора падает в ˜1,5-2 раза в течение 1-2 сут.

Пример. 10. Приготовление биокатализатора

Аналогичен Примеру 1, только для приготовления биокатализатора используют биомассу клеток пекарских дрожжей с влажностью 70-80% и удельной активностью 600 мкмоль/мин/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора равна 30 мкмоль/мин/г. При иммобилизации сохраняется ˜50% от исходной активности клеток в суспензии. Биокатализатор сохраняет более 80% начальной активности свежеприготовленного биокатализатора через 60 ч работы в условиях непрерывного процесса инверсии сахарозы в глюкозо-фруктозный сироп при 50°С.

Пример 11. Получение глюкозо-фруктозного сиропа

Используют биокатализатор по примеру 1. Приготовленный биокатализатор помещают в колоночный проточный реактор, и при 70°С через неподвижный слой с объемной скоростью циркуляции 0.042 л/час прокачивают реакционную среду следующего состава: 0.02 М фосфатный буфер рН 7.8; сульфат Mg(II) в концентрации 1 мМ; сульфат Со(II) в концентрации 1 мМ. Концентрация глюкозы составляет 44 вес.%, отличается тем, что объемную скорость потока реакционной среды варьируют от 0.018 л/ч до 0.42 л/ч. Результаты испытаний приведены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, увеличение объемной скорости потока субстрата через неподвижный слой биокатализатора (≥0.042 л/ч) приводит к 2-кратному падению конверсии субстрата.

Таблица 3Конверсия субстрата в зависимости от скорости потока через неподвижный слой биокатализатораСкорость потока раствора субстрата через слой биокатализатора, л/чКонверсия субстрата*, % за 1 ч работы биокатализатора0.018120.042120.14460.426* - доля прореагировавшего субстрата

Пример 12. Получение глюкозо-фруктозного сиропа

Аналогичен примеру 11, отличается тем, что используют биокатализатор по примеру 6 и проводят реакцию изомеризации 42%-ного раствора фруктозы в глюкозо-фруктозный сироп при 60°С. Результаты испытаний аналогичны приведенным в таблице 3. При увеличении объемной скорости потока субстрата через неподвижный слой биокатализатора конверсия субстрата падает в ˜2 раза.

Пример 13. Получение глюкозо-фруктозного сиропа

Биокатализатор по Примеру 10 помещают в колоночный проточный реактор, и через неподвижный слой биокатализатора (0.2 г) прокачивают раствор субстрата (0.01 л) с объемной скоростью циркуляции 1.8 л/час при 50°С. Состав реакционной смеси следующий: 0.05 М ацетатный буфер рН 4.6; 20% сахароза.

Конверсия субстрата за 20 ч работы биокатализатора составляет 100%, что соответствует получению глюкозо-фруктозного сиропа.

Как видно из приведенных примеров и таблицы 2, оптимальный состав основных компонентов (БКГИА и гидрогеля диоксида кремния по сухим веществам) составляет от 1:6 до 1:10. В этом случае биокатализатор для изомеризации глюкозы или фруктозы обладает хорошей устойчивостью в реакционной среде со значением рН 7.8 и высокой механической прочностью для использования в проточных реакторах. Повышение содержания бактериальных клеток в биокатализаторе препятствует образованию текстуры диоксида кремния, что приводит к снижению устойчивости биокатализатора в реакционной среде. Из приведенных примеров и таблицы 2 также видно, что повышение продолжительности сушки с 2 ч до 4 ч приводит в 3-кратному падению ферментативной активности биокатализатора вследствие термоинактивации внутриклеточной глюкозоизомеразы. Активность биокатализатора не зависит от размера его гранул в широком интервале от 0.4 мм до 3.0 мм, что свидетельствует о том, что биокатализатор работает с максимальной эффективностью в кинетической области и диффузионное торможение в реакции изомеризации моносахаридов отсутствует.

Таблица 2Состав, способ получения и свойства биокатализаторов по примерам 1-8.№ примераШифр гидрогеляАктивность БКГИА в суспензии*, мкмоль/мин/г_{сухих клеток}Соотношение основных компонентов БКГИА/SiO₂**Условия получения биокатализатораТекстурные свойства биокатализатораБиокаталитические свойства***T_сушки, °CПродолжительность сушки, чS, м²/гV_пор, см³/гD_пор, нмРазмер гранул, ммАктивность, мкмоль/ мин/гt¹/₂, ч1I 1:107022900.8100.4-3.018222III 1:107022900.8110.5-2.018213IV 1:107022900.8100.4-3.020224VI2701:107022900.8120.5-2.019235VII 1:10702500.3151.0-2.019226I 1:67022500.7110.5-2.025207I4701:57022300.8100.4-3.062-8I1:57042001.0130.4-0.521-Обозначения:* - бактериальные клетки с глюкозоизомеразной активностью;- весовое соотношение основных компонентов биокатализатора: БКГИА и гидрогеля (в пересчете на сухие вещества), содержание дополнительных компонентов MgSO₄ и CoSO₄ составляет 1 мкмоль/г сухого биокатализатора;*** - свойства определяют в реакторе при скорости потока через неподвижный слой биокатализатора 0.042 мл/мин.

Изобретение относится к области биотехнологии. Биокатализатор для получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, который содержит бактериальные клетки с глюкозоизомеразной активностью, диоксид кремния и соли магния и двухвалентного кобальта, при чем соотношение бактериальных клеток и диоксида кремния составляет от 1:6 до 1:10 в весовых частях по сухим веществам. Диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажность 60-95%, величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 0.1-0.7 г/см³. Изобретение позволяет ускорить и упростить процесс иммобилизации бактериальных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, а также сохранить на высоком уровне ферментативную активность клеток после иммобилизации. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Биокатализатор для получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, включающий бактериальные клетки с глюкозоизомеразной активностью, растворимые соли магния и двухвалентного кобальта, диоксид кремния, при этом соотношение основных компонентов биокатализатора - биомассы бактериальных клеток и диоксида кремния, используемого в виде гидрогеля с влажностью 60-95%, составляет от 1:6 до 1:10 в весовых частях по сухим веществам.2. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что диоксид кремния содержится в виде гидрогеля со следующим набором свойств: величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 0,1-0,7 г/см³.3. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что в качестве дополнительных компонентов биокатализатора он содержит растворимые соли магния и двухвалентного кобальта в виде сульфатов, или нитратов, или хлоридов в количестве 1-1,2 мкмоль на 1 г сухого биокатализатора.4. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что он имеет величину удельной поверхности 50-300 м²/г, объем пор 0,3-1,0 см³/ и диаметр пор 10-15 нм.5. Способ приготовления биокатализатора для получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, характеризующийся тем, что иммобилизацию бактериальных клеток с глюкозоизомеразной активностью в диоксид кремния проводят путем смешения биомассы бактериальных клеток в виде влажной пасты, диоксида кремния в виде гидрогеля и солей магния и двухвалентного кобальта в виде водных растворов солей серной, или азотной, или соляной кислоты с последующей сушкой полученной смеси на воздухе при температуре 50-70°С в течение не более 2 ч, прессованием и грануляцией в частицы размером от 0,4 до 3,0 мм.6. Способ по п.6, отличающийся тем, что диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажность 60-95%, величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 0,1-0,7 г/см³.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия или калия с минеральной кислотой, выбранной из ряда серная, или азотная, или угольная, или путем взаимодействия с аммонийными солями серной, или азотной, или угольной кислот при значении рН 6,5-9, температуре 20-90°С, скорости осаждения 30-300 г SiO₂/л_сусп/ч с последующей отмывкой и фильтрацией гидрогеля.8. Способ получения глюкозо-фруктозных сиропов в процессе изомеризации глюкозы или фруктозы, отличающийся тем, что используют биокатализатор для изомеризации глюкозы или фруктозы по пп.1-4 или приготовленный по пп.5-7.9. Способ по п.8, отличающийся тем, что реакцию проводят в реакторе с неподвижным слоем при температуре 60-70°С и при скорости потока реакционной среды, содержащей глюкозу или фруктозу, через слой биокатализатора 0,02-0,04 л/ч.10. Способ по п.9, отличающийся тем, что биокатализатор используют в виде частиц размером от 0,4 до 3,0 мм.