Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью Советский патент 1992 года по МПК C12N11/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам иммобилизации микробных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения глюкозоф- руктозного сиропа.

Известны способы получения иммобилизованных препаратов глюкозоизомера- зы.

Недостатками данных способов являются использование в качестве носителей сырья, в основном, пищевого назначения, сложность получения иммобилизованных препаратов, так как требуется проведение дополнительной обработки сшивающим агентом для обеспечения механической и термической прочности и недостаточно высокая активность получаемых биокатализаторов.

Известен способ иммобилизации клеток Streptomyces albogriseolus 28-3, обладающих глюкозоизомеразной активностью, в гель гидроокиси кобальта (II), для чего их суспендируют в водном растворе ацетата кобальта при массовом соотношении сухих клеток и соли кобальта 1 :(0,1-10,0). Далее по каплям приливали концентрированный раствор аммиака до рН 6,5-10,0. Полученный осадок отфильтровывали, промывали водой и фосфатным буфером (рН 7,0). высушивали и измельчали. Готовый иммобилизованный препарат имел активность 133 ед/г влажного препарата.

Недостатком этого способа является то. что конечный продукт имеет вид порошка, а

ч|

°°

|00

ел

применение биокатализатора в таком виде в промышленных условиях невозможно.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения биокатализатора на основе Streptomyces albogriseolus 28-3. согласно которому биомассу предварительно суспендируют в растворе ацетата магния, Суспензию смешивают с хитозаном, растворенным в водном растворе ацетата кобальта (II), проводят гранулирование геля введением полученной смеси в 8%-ный водный раствор аммиака, при этом конечные концентрации компонентов в препарате составляют, масс.%: биомасса клеток (по сухой массе) 3,0-10,0; ацетат кобальта (II) 7,0-15,0; хитозан 1.0-4,0.

Недостаток этого способа иммобилизации заключается в том. что при использовании полученного препарата в колонном реакторе для процесса изомеризации глю- козного сиропа, который протекает при температуре 60°С, наблюдается интенсивное вымывание ионов Со + из биокатализатора. Вследствие этого происходит загрязнение конечного продукта - глюкозофруктозного сиропа ионами кобальта, его окрашивание в розовый цвет, что по требованию к пищевым продуктам совершенно недопустимо. Проведение дополнительной очисткиглю- козофруктозного сиропа до содержания допустимых концентраций кобальта сопряжено с усложнением процесса.

Целью изобретения является повышение ферментативной активности и прочно- сти гранул целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизоме- разной активностью, проводят включение клеточной биомассы в нерастворимый носи- тель. Для этого клетки Streptomyces albogriseolus 28-3 смешивают с раствором хитозана (рН 4,0-4,5), добавляют в эту смесь водный раствор соли кобальта (III) и прово- дят гранулирование препарата путем закапывания в 5-10%-ный водный раствор аммиака. При этом исходное соотношение компонентов, взятых для получения препарата (в расчете на сухие вещества) должно быть следующим: клеточная биомасса:хитозан:ацетат кобальта (III) как 1:(0,1-0,5):(0.15-1,5).

Выбор 5-10%-ных растворов аммиака в качестве осадителя обусловлен тем, что именно в растворе аммиака (а не какого-то другого щелочного раствора) такой концентрации (5-10%) происходит формирование гранул биокатализатора с необходимой механической прочностью. При проведении стадии гранулирования в растворе аммиака

происходит процесс включения клеток в двойной гель: в гель хитозана, который изменяет свою растворимость при щелочном рН, и в гель гидроокиси кобальта (III). Снижение концентрации аммиака ведет к снижению механической прочности образующихся гранул и удлинению процесса их формирования. Увеличение концентрации аммиака выше указанных значений также приводит к снижению механической прочности из-за чрезмерно быстрого формирования геля.

Приготовление ацетата кобальта (III) проводилось на основе водных растворов ацетата кобальта (II) при окислении их с помощью 3%-ного раствора перекиси водорода. Использование более концентрированных растворов перекиси водорода приводит к частичной инактивации фермента.

Пример. 12 г влажных клеток (влажность 90%) актиномицетов Streptomyces albogriseolus 28-3, полученных после центрифугирования культураль- ной жидкости и обладающих активностью 48 ед./г, смешивают с 4 мл 3%-ного раствора хитозана (рН 4,3 доводится 5%-ным раствором уксусной кислоты), добавляется 4 мл предварительно приготовленного 15%-ного раствора ацетата кобальта (III). Соотношение компонентов, взятых для получения препарата (в расчете на сухие вещества) следующее: клеточная биомасса:хито- зан:ацетат кобальта (III)- 1:0,1:0,5. Полученную смесь закапывают в 8%-ный водный раствор аммиака с целью получения прочного гранулированного катализатора. Активность влажного иммобилизованного препарата 190,4 ед./г.

За единицу активности глюкозоизоме- разы принимали количество фермента, катализирующее изомеризацию одного микромоля глюкозы во фруктозу при рН 7,0 и температуре 60°С за 1 мин. В качестве субстрата использовали 2 М раствор глюкозы с добавлением М ионов Мд2+.

Глюкозоизомеразная активность препарата, полученного по прототипу, составляет 175 ед./г влажного препарата и принята за 100%.

Остальные примеры иммобилизации клеток, характеризующие данный способ, проводят аналогично примеру 1, изменяя лишь соотношение исходных компонентов; концентрацию осаждающего раствора аммиака и рН раствора хитозана. Их результаты представлены в табл. 1.

Результаты иммобилизации клеток даны в табл. 2.

Результаты термомеханических исследований иммобилизованных препаратов даны в табл. 3.

Гранулы биокатализатора, полученные по известному и предлагаемому способам, были подвергнуты термомеханическим исследованиям. С этой целью было проведено изучение зависимости величины относительной деформации гранул биокатализатора от температуры с помощью термомеханического метода (при использовании нагрузки 100 г).

На прочность были испытаны образцы катализаторов, полученные сразу после иммобилизации по двум сравниваемым способам, а затем те же самые образцы, но уже после их термостатирования при 60°С в 0,01 М Na-малеатном буфере (рН 6,8) - традиционные условия исследования стабильности препаратов с глюкозоизомеразной активностью - на протяжении 15 сут. (табл. 3).

При температуре 60°С (оптимальные условия проведения процесса изомеризации) исходно лучшими прочностными характеристиками обладает препарат на основе хитозана и гидроокиси кобальта (III) (предлагаемый вариант). Остаточная деформация такого образца на 16% меньше (при 60°С) той, которую имеет препарат, полученный по известному способу. Более того, механические свойства катализатора, полученные по известному способу, претерпевают изменения в сторону ухудшения в результате его испытания в водной среде при 60°С вследствие сильной набухаемости гелевых гранул. Одновременно с этим из носителя происходит частичное вымывание ионов Со +. Подобное явление отсутствует в препарате, полученном согласно предлагаемому способу, В результате прочностные характеристики биокатализатора (относи0

5

0

5

0

5

0

тельная деформация образца 28%) в 2 раза превосходят те же параметры для известного препарата (относительная деформация 53%).

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить удельную активность иммобилизованного препарата на 15-20%, а также получить целевой продукт с улучшенными механическими свойствами. Реактивы, используемые в иммобилизации, дешевы и доступны. Для реализации способа не требуется использования сложного или нестандартного оборудования.

Ф о рмула изобретения

1.Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, включающий приготовление смеси биомассы Streptomyces albogriseolus 28-3 с растворами хитозана и ацетата кобальта при рН 4,0- 4,5, формирование гранул геля введением полученной смеси по каплям в водный раствор аммиака, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности и прочности гранул целевого продукта, приготовление смеси осуществляют путем введения биомассы в раствор хитозана, а затем добавляют раствор трехвалентного ацетата кобальта.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что компоненты, необходимые для приготовления преперата, берут в следующем соотношении по сухим веществам: клеточная биомасса:хитозан:ацетат кобальта (III), - 1:(0,1-0,5):(0.15-1,5).

3.Способ по п. 1,отличающийся тем, что для формирования гранул геля используют 5-10%-ный водный раствор аммиака.

Таблица 1

Продолжение табл.1

Изобрение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам иммобилизации микробных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, и может быть использовано в пищевой промышленности при производстве глюко- зофруктозного сиропа. Цель изобретения - повышение ферментативной активности и прочности гранул целевого продукта. Включение клеток Streptomyces albogriseolus 28- 3 в нерастворимый носитель осуществляют путем смешивания клеточной биомассы с раствором хитозана с рН 4,0-4,5 и затем с водным растворим трехвалентного ацетата кобальта при соотношении компонентов 1:(0,1-0,5):(0,15-1,5) соответственно. Далее проводят гранулирование иммобилизованного препарата путем введения капель полученной смеси в 5-10%-ный водный раствор аммиака. Способ позволяет повысить удельную активность иммобилизованного препарата по сравнению с известным на 15-20%. 2 з.п. ф-лы, 3 табл. со

Таблица 2

Таблица 3