Способ определения сенсибилизации организма вирусом гриппа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для оценки состояния сенсибилизации и клеточного иммунитета при гриппозной вакцинации и инфекции.

Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь испытуемого организма собирают во флаконы с гепарином (20 ед. гепарина на 1 мл крови), подсчитывают количество лейкоцитов в 1 мм3 крови, кровь разливают по 0,5 мл в силиконизированные пробирки, в одну из которых добавляют 0,2 мл (контроль) забуференного физиологического раствора (рН 7,4), в другие - антиген в том же объеме (опыт). Материал из пробирок после 20-минутного выдерживания при 37°С переносят в капилляры (3-4 каппилляра на каждую пробу), капилляры ставят в штатив, последний помещают в горизонтальном положении в термостат при 37°С на 30 мин. Для постановки реакции используют стеклянные градуированные капилляры и штативы, предназначенные для определения скорости оседания эритроцитов по микрометоду Панченкова. При этом капилляры заполняют кровью до метки 50. После инкубирования содержимое капилляров сливают в отдельные пробирки, капилляры дважды промывают равным объемом физиологического раствора, сливая его в те же пробирки, и производят подсчет лейкоциты. Затем вычисляют число прилипших лейкоцитов (ПЛТ) к каждому капилляру (в%) по формуле

100.

- Г8где П - количество прилипших лейкоцитов, %.; А-исходное количество лейкоцитов в 1 ммг;

В- количестве иышедшн леикоциюпв 1 мм3.

При расчете вносяi поправки, учи или и1 разведение крови раствором антигена и физиологическим раствором при промывке к а пилляров Цифровой мемориал по прилипаемости лет опиши (ПЛ) по ктгцои пробе (3 4 капилляре) пЬраг ан. г;ти- стически с вычислением М - п Если 111 ноч влиянием антигена по сравнению с котро- лем повышается достоверно (Р 0,05). то результат реакции считаю г пс О ителы-и ч i свидетельствующим о нлгпц.,1 i rjnriiio мши сенсибилизации организме

Разность (в %) принимаемо; ги леи коцитов межд1 конгро ь-м (ID. ih i be - HI гигена) и оптом (проба с м игеппм) используют в качестве иыгеюальною показателя напряженности клеточного иммунитета и сенсибилизации оргсшшма

Антигены нмрусоо ipiinna i отопи i ,i нее. Вирусы гриппа размножаю pa и п вающихся куриных эмбрионах, сооранн пи вируссодержащую аллантоиснуи жидкость очищают и концентрируют методом ультра- центрифугирования в фадиенте плотности сахарозы,инактивируют формалином, освобождают от микробной флоры и блчториальНЫХ ПРОДУКТОВ уЛЬТрс.1ф(|ЛЬ Tfj 1ЦИ1Г i (i J

каскад миллипоровых .)и, ,, niy.iupy ют и сохраняют при i4°C ПодоЬч ч i . , логия приготовления вирусного м i,j,,.u , соответствует технологии п; ои.и,, , л i j инактивированной гриппозной иикцит/

При добавлении к вирусной суспензии стабилизатора в виде сыворото но и чело веческого альбумина (конечная и нценгра ция 0,2%) содержание антигена выряжает в гемагглютинирующих единицах ( АС) без добавления - в микрограммах белка, опре- деляемого по ,ппури. Возможно применение в качестве антигена гриппозной инактивированной вакцины Принятый метод изготовления вирусного материала гарантирует его чистоту, стандартность стерильность и возможность длительного ранения Степень очистки вирусного материала по белку - не менее 98%

Антигенный материала по вышеуказан ной технологии получают из штаммов виру- са гриппа A(PR)8/34 (M1M1); А(Киеп)59/79К (H1N1), А(Чили)/83/Я2 (H1N2); А(Ленин- град) 385/SOR (H3N2). А(Филиппины)59/1 (H3N2); Х-79 (H3N2), А(Миссисипи)1/85 (H3N2), а также из вируса болезни Ньюкасл (вакцинный штамм Н) и вируса парагриппа I типа Сендай Е-109

П р и м е р 1 Добровольца (серологический № 97) вакцинируют вирусом гриппа А(Новошахтинск)3/8б/15 (H1N1) кандидатом и / мгй ie i оиппозные вакцины, интрана- зально в дозе 0,5 мл (биологическая-актив- ность 10fi ЭЙД 50/0,2 мл). Производят ревакцинацию чтим же виоусом и в той же Титры аптигемаплют нинов в сыво- ригкг- 1-ров определяют по реакции торможения томен т лютинаиии с тем же вирусом в исходном периоде, г е. 14 дней после игжцинэции и 14 дней после ре ч цинации. Состояние сенсибилизации организма вирусом гриппа определяют в исходном пе- рмоде до вакцинации) на третий и четыр- г(лдцап1и дни после вакцинации и 14 дней пг/гле реичкцпнации В качестве антигена ,1гпол ii KiT «ih, шппргванш i иирус грип- n i / {млн)1 В ( г .ч, .й формулой 111 I, i in St. 11 i ну u i ,eii (.-г (чему штам- i ( о (ор кян«|Г г .т-д. г/н,хинина - 2560 i л/0 . м : Крои , п « TIT п яимевой ве п. п, чгмя и ко i-4 тп г-нт-коагулянта ге|,1|| 1Н В ДиЗО 0 РДПНИЦ/НП

v 41 гмп т лэдсрх Ы /(е лейкоцитоз е 1мм ici o.ib ,yv ленюцитнрные меланже- рп or/-Hjio vi мую кислоту для лизиса

Kir i гцитов i, KdML py i opnetid Кровь разли- t.riioi пи 0 5 мл в две силиконизированные лрпянрки В одну пробирку добавляют 0,2 мл : и т .гон { ,iit,iil a ;ipyi ун/ (кон тро,1ь) - 0,2 мл

1/фс| en (Oiu ччО Югичеокого раствора С , i . 4) Послг. перемешивания и инкубиро i i ,iii п( i 5/V содержимым каждой

.к1ч;) р и jano/мяют 4 капилляра до метки «rHivsj1 1Я11( i ставят в (итатпв, последние илшщй л с г )ризонтальном положении в I PMOCT.JT на 30 ми при 37°С После инку- Г11ции ;,011 и к 1мос | аждого капилляра сли- в,.юг i отдельную пробирку, дважды пром LdO, физиологическим рпствором, паЬирая последний до метки оО и сливая в i, лче пробирку В пробирке определяют количество лейкоцитов а 1 MMJ, используя лей- оцитарные меланжооы 3%-ную уксусную -HI лоту и камеру Горяева Далее рассчиты- r,,ioi проц -in тф импших лейкоцитов по м зонной |)орму/ е для каждого капилляра в 1) ii oni,iif После статистической оооаботки материала с вычислением М ± m п дгсюнсрногги р-)личий между пробами ггз антигена и с антигеном определяют напряженность клеточного иммунитета и сен- сиЬилизацин организма вирусом гриппа путем вычитаьия % ПЛ в контроле Из % ПЛ г- опыте

В исходном периоде, т.е до вакцинации добавление антигенов вируса гриппа не привело к изменениям ПЛ. Напротив уже к третьему дню и особенно к четырнадцатому дню после вакцинации наблюдали значительное повышение ПП Повышение ПЛ составило 26% по сравнению с контролем

После ревакцинации ПЛ также несколько повысилось до 30% в сравнении с контролем. Титр антигемагглютининов увеличился в 4 раза через 2 недели после вакцинации (положительная сероконверсия) и не изменился после ревакцинации.

Результаты опыта подтверждают, что после иммунизации живой гриппозной вакциной развивается состояние сенсибилизации организма к вирусу гриппа, определяемое предлагаемым способом, основанным на реакции повышения прили- паемости лейкоцитов.

В сравнении с прототипом увеличивается точность определения сенсибилизации организма вирусом гриппа при использовании предлагаемого способа.

Так, коэффициент вариации по прототипу почти в 2 раза превышает аналогичный по предлагаемому способу (47% против 25%), т.е. точность увеличивается в 1,8 раза. По сравнению с прототипом наблюдается и

упрощение способа за счет исключения про-; цедуры выделения лейкоцитов из исследуемой крови.

Формула изобретения

Способ определения сенсибилизации организма вирусом гриппа, включающий иммунизацию, забор крови в две пробы.

подсчет количества лейкоцитов, инкубацию проб с антигеном с последующим учетом реакции в капиллярах, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа за счет исключения этапа выделения лейкоцитов, в качестве антигена используют очищенный вирус гриппа с последующим подсчетом числа прилипших к стенкам капилляра лейкоцитов и при повышении числа прилипших лейкоцитов в

пробе с антигеном по сравнению с пробой без антигена определяют наличие сенсибилизации организма к вирусу гриппа.

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для оценки состояния сенсибилизации после вакцинации вирусом гриппа. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. Людей вакцинируют вирусом гриппа, проводят забор крови в количестве 1 мл, подсчитывают количество лейкоцитов, инкубируют очищенным вирусом гриппа в течение 20 минут при 37°С. Затем кровью заполняют капилляры и повторно инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После инкубирования капилляры промывают, подсчитывают число прилипших к стенкам капилляров клеток и при повышении количества прилипших клеток в пробе с антигеном по сравнению с контролен определяют сенсибилизацию организма вирусом гриппа. В сравнении с прототипом увеличивается точность способа в 1,8 раза и способ упрощается за счет исключения процедуры выделения лейкоцитов из проб крови.