Способ определения состояния клеточного иммунитета организма Советский патент 1983 года по МПК A61B10/00 

х Изобретение относится к области медицины. Известен способ определеняя состояния клеточного иммунитета организма путем выделения лейкоцитов из крови сенсибилизированного организма с пооледдуюьжм заполнением капилляров взвесью лейкоцитов, куль тивированием их в питательной среде VS измерением зон миграции лейкоцито под действие специфического антиге на i , Однако известный спс.соб ве позво ляет точно определить оостояние при гриппе, Целью изобретения является новышение точности определения состояни организма при гриппе. Цель достигается тем, что по предлагаемому способу определения состояния клеточно.о иммунитета организма путем выделения лейкоцитовиз крови сенсибилизированного орган ма с последующим заполнение капилля ров взвесью лейкоцитов, кульм:ивиро-ганием их в питательной среде и измерением зон миграции лейкоцитов по действием специфического анти;гена, лейкоциты предварительно выдерживаю с вируссодержащей аллантоисной жидкостью, для заполнения капилляров используют образовавшийся осадок лейкоцитов с адсорбированным вирусом Способ осуществляют следующим образом. Вирус гриппа (неочищенную и неконцентрированную вируссодержашую аллантоисную жидкость с титром ге 1а1тлютининов 1;256) добавляют ,не в среду культивирования клетоКр а к взвеси лейкоцитов непосредствбНЕЮ после их выделения. Смесь ин-кубируют при в течение 3 Ci мин , для адсорбции вируса на лейкоцитах, надосадочную жидкость удаляют после центрифугирования в течение а О мин при 800 об/мин о Полученным осадком клеток заполняют капилляры с внутрен ним диаметром О,, 6 мм и помецс1ют в камеры со средой 199 и 1% ал11бу1 лина человека, инкубируют при в теч ние 24 ч, опред(гляют площади миграции клеток в опыте (лейкоциты -f вирус) и контроле (лейкоциты без вируса) . По их отношению (индекс миграции) судят о степени сенсибили зации организма к антигенам вируса гриппа. Соотношение лейкоцитов и ви руса гриппа оптимально при добавлен к 6-10 клеток 2 мл вируссодержащей аллантоисной жи;цкости с т1-ггром глютининов 1:256. Пример Лейкоциты выделяют из 15 мл гепаринизированной крови людей добавлением 2 мл 3%-ной желатины. Через 15 мин после осаясдения эритроцитов со взвешенными клетками переносят в центрифулные пробирки, центрисоугируют 10 мин при 800 об/мин, к оссгдку клеток для лизиса эритроцитов добавляют 5 мл холодного 0,83 6-нoгo раствора хлористого амгиония ( тщательно перемешивают, снова центрифугируют при тех же параметрах и однократно отмывают 5 мл холодного забуференного физиологического раствора (рП -- 7,2) . Осадок клеток делят на две равные части. Одна из них используется для заполнения капилляров, которые помещают в контрольные камерЕл. Ко второй части клеток добавляют 2 мл вируссодержащей аллантоионой жидкости с титром гемагглютининов 1:256 (вирус гриппа Л/Ленинград 0139/76 (Н., N;) , смесь инкубируют при 4Св течение 30 мин, центрифигуоируют 10 мин при 800 , надосадок полностью удаляют, а взвесью клеток с адсорби1эованны { на них варионами заполняют капилляры, которые пометают в опытные камеры. Перед внесением капилляров в камеры один конец его запаивают, капилляры дентрифугируюТ 5 мин при 800 об/мин и обламываьэт ниже границы слоя клеток,. Отрезок капилляра с клетками укладывают на дно камеры запаянным концом в каплю стерильного вазелинового масла. Контрольные и опытные камеры заполЕ яют средой 199 с 1% ал1.-бумина челове-а и антибиотиками без антигена. На протяжении всего периода поставки реакции, начиная с момента выделения и до внесения в ;амеру со средой, клетки сохраняются на холоду ( в банках со льдом), а в момент разрезания капилляров их помещают в чашки Петри, которые кладут на лед. Герметически закрытые камеры инкубируют в течение 24 ч при 37°С. Для одмого исследования используют 4 контрольных и 4 опкггных капилляра. По окончанрш срока инкубации с помощью фотоувеличителя регистрируют площадь маграции клеток в опытных и Контрольных камерах. Зону миграции вырезают и взвешивают на торзионных весах, индекс ми:граци вычисляют: средний вес площа-i дей миграции под влиянием вируса средний вес в котроле. гриппа; р В таблице приведены результаты параллельного определения состояния кле.точного иммунитета (ГЗТ) у людей, привитых инактивированной гриппозной АГХ-вакциной из штамма вируса гриппа А/Ленинград70139/76/, через 20 дней после двукратного введения препарата в прямом капиллярном тесте в предлагаемой модификации и при постановке

известным ,способом. В известном, способе в среду культивирования добавляли вирус гриппа, очищенного сорбциейэлюцией на куриных эритроцитах и сконцентрированного центрифугированием при 20 тысячах об/мин в течение 2 ч на центрифуге ЦВР-1, конечный титр гемагглютинина в среде культивирования был равен 1:256.

Как видно из данных/ приведенных в таблице различия в уровне тормо(жения миграции лейкоцитов под влиянием вируса гриппа А 2 при использовани предлагаемого способа по сравнению .с известным, статистически достоверны (р ГО,001) и подтверждают большую точность предлагаемого способа (индекс торможения миграции в известно способе - 0,,05, а в предлагаемом - О,26-0,06).

Добавление к лейкоцитам аллантоисной жидкости незаряженных куриных эмбрионов не влияло на показатели реакции, различий по сравнению с контролем не отмечено.

При исследовании с помощью предлагаемого способа ГЗТ у привитых через 10 дней после повторного введения вакцины наблюдали резкую ингибицию миграции (индекс торможения миграции составлял 0,05). В отдаленные сроки-(3-6 месяцев после иммунизации) индексьа повышались до 0,20,7. При изучении ГЗТ известным способом индексы миграции колебались от 0,5 до 0,7, независимо от срока, прошедшего после прививки, СледовательноГ с помощью предлагаемого способа более точно удается определить состояние клеточного иммунитётЗ у людей, сенсибилизированных к антигенам вируса гриппа.

Индексы торможения миграции лейкоцитов, привитых гриппозной инактивированной вакциной из штамма А/Н, N / при использовании известного и предлагаемого способа

Х- индекс торможения миграции.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ОРГАНИЗМА путем выделения лейкоцитов из крови сенсибилизированного организма с последующим заполнением капилляров взвесью лейкоцитов, культивированием их в питательной среде и измерением зон миграции лейкоцитов под действием специфического антигена, отличающий СИ тем, что, с целью повышения точности определения состояния организма при гриппе, лейкоциты предварительно выдерживают с вируссодергащей аллантоисной жидкостью,для заполнения капилляров используют образовавшийся осадок лейкоцитов с адсорбированным вирусом.