Способ определения перекиси водорода в биологических объектах Советский патент 1991 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения перекиси водорода в биологических образцах.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа при одновременной возможности осуществления способа в присутствии гемсодержащих пигментов.

Способ осуществляется следующим образом.

К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, пероксидазу и в качестве хромогена смесь гваякола и п-ами- нодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,05-0,5 М. Пробу инкубируют до прекращения увеличения

оптической плотности и спектрофото- метрируют против контрольной пробы, не содержащей перекиси водорода. По величине оптической плотности определяют содержание перекиси водорода.

Пример 1. Анализ перекиси водорода в растворах.

К 10-2000 мкл анализируемой пробы, содержащей 10-500 нмоль Н20г, прибавляют 400 мкл 0,5 М фосфатного буфера, рН 7,0-7,5, 400 мкл 2 мМ гваякола и 400 мкл 2 мМ сульфата n-аминодиэтиланилина (или дигидро- хлорида п-аминодиметиланилина). Объем проб доводят до 3,8 мл водой. Реакцию начинают прибавлением 200 мл 0,1%-ного раствора перексидазы хрена и через 5 мин (можно и через

о со оэ i i ю

5-30 мин) измеряют оптическую плотность растворов при 625 нм на спектрофотометре или при 670 нм на фото- электроколориметре КФК-2МП против контроля, содержащего вместо перекиси водорода воду. Содержание в исходной пробе определяют по калибровочному графику по следующей формуле, мМ: ,J

г - , С-,

где п - разведение исходной пробы

перед введением в инкубиру- ему смесьJ

V - объем вносимой пробы, мл;

D - оптическая плотность раствора против контрольного, не содержащего FLO,:

k - коэффициент для , нахо- димый из калибровочного опыта (обычно в описанных условиях для фотоэлектроколоримет- ра КФК-2МП он равен 0,35). Пример 1. Исходную пробу, ,одержащую , развели в 100 раз. Для анализа взяли 0,1 мл. Оптическая плотность фотометрируемого раствора составила 0,210 (ФЭК КФК-2МП, 670 нм , 1 см). Калибровочный коэффициент (т.е количество микромолей Н,0г в 4 мл пробы, соответствующей оптической плотности 1) для данных условий равен 0,35.

Следовательно, исходная концентра- ция равна С 73,5 мМ.

Пример 2. Анализ перекиси водорода, генерируемой в оксидаз- ной реакции (метод определения активности оксидаз).

А. Определение активности алкоголь оксидазы. К анализируемой пробе (5- 100 мкг белка) прибавляют 400 мкл 0,5 М фосфатного буфера, «рН 7,0-7,5, 400 мкл 2 мМ гваякола, 400 мкл 2 мМ сульфата n-аминодиэтиланилина (или дихлоргидрата п-аминодиметиланилина), 400 мкл 100 мМ метанола, объем пробы доводят до 3,8 мл водой. Реакцию начинают прибавлением 200 мкл 0,1%-ной пероксидазы хрена (Реанал RZ 0,6) и через 30 с измеряют приращение оптической плотности за 1 мин при 670 нм фотоэлектрокалориметра КФК-2МП в режиме Активность. Удельную актив- ность фермента (генерируемой перекиси водорода за 1 мин на 1 мг белка) рассчитывают по формуле, мкмоль:

Q

5

5

Л

и О 5

40

0 5

45

А ;&Р/мин . k- n

где ДБ/мин - приращение оптической

плотности за 1 мин; п - разведение раствора

фермента перед прибавлением реагентов; V - объем раствора фермента, вводимого в пробу, мл

Сй - исходная концентрация белка, мг/мл; k - коэффициент для , находимый из калибровочных опытов, (Б описанных условиях он равен 0,35).

Исходную пробу бесклеточного экстракта метилотрофных дрожжей, содержащего алкогольоксидазу, развели в 100 раз. Концентрация белка в исходном экстракте 5,5 мг/мл. Для анализа взяли 0,2 мл. Приращение оптической плотности за 1 мин составило 0,125 (ФЭК КФК-2МП-, 670 нм; 1 см). Калибровочный коэффициент в данных условиях равен 0,35. Следовательно, удельная активность алкогольоксида- зы в исходном экстракте равна А 3,98 мкмоль/мин мг белка.

Б. Определение активности глюкозо- оксидазы. Анализ и расчет проводят точно так же, как в примере 2А с той лишь разницей, что вместо метанола используют 100 мМ глюкозы, а в качестве буфера используют 0,5 М цитрат-NaOH, рН 6,0.

Граничные значения концентрации хромогенов (концентрация HgOj, 50 мкМ) предлагаемого способа сведены в табл.1.

Чувствительность предлагаемого способа повысилась в 2,5 раза.

В табл.2 дано сравнение чувствительности определения перекиси водорода по предлагаемому методу (хромоген - смесь гваяколы и п-аминодиэти- ланилина) и известному (хромоген - п-фенилендиамин). Условия: 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,0-, концентрация хромогенов 0,25 мМ$ пероксидазы хрена (RZ 0,6) 0,05 мг/мл. Спектрофотометр СФ-26, 1 см.

Возможно определение перекиси водорода в присутствии гемсодержащих пигментов, в частности гемоглобина крови.

516

Влияние гемолизата крови на определение перекиси водорода по предлагаемому методу (хромоген - смесь гваяколы и n-аминодиэтиланилина) и 1 известному (хромоген - п-фениленди- амин) показано в табл.3. Условия аналогичны табл...

и n-аминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,05-0,5 мМ.

Таблица 1

Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения перекиси водорода в биологических образцах и системах, генерирующих . Цель изобретения - повышение чувствительности способа при одновременной возможности осуществления способа в присутствии гемсодержащих пигментов. К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, пероксидазу, а также смесь гваякола и п- аминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,05-0,5 мМ. Пробу инкубируют до прекращения увеличения оптической плотности и спектро- фотометрируют против контрольной пробы, не содержащей перекиси водорода. По величине оптической плотности определяют содержание перекиси водорода. Способ позволяет повысить чувствительность в 2,5 раза. 2 табл. с 5S (Л

Как следует из табл.3, при анализе в пробах, содержащих кровь (гемолизат), с помощью известного способа резко повышается оптическая плотность холостой пробы (контроля) - до 0,510 при разведении крови в 100 раз, чторезко ухудшает удобство, точность и чувствительность анализа. В случае применения предлагаемой хромогенной системы (гваякол + + n-аминодиэтиланилин) оптическая плотность контроля в присутствии крови в 7,5 раз ниже по сравнению с известной, что связано с неперекрыванием спектров поглощения продукта реакции и гемоглобина.

10

0,01

0,025

0,05

0,1

0,25

0,375

0,5

0,75

1,0

2,5

5

25