Способ определения пироксидазной активности биологических объектов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения пероксидазной активности в биологических образцах и в иммуноферментном анализе.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, перекись водорода и в качестве хромогена смесь гваякола и n-аминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,25-0,75 мМ. Пробу инкубируют, измеряя прирост оптической плотности во времени.

Пример 1. Анализ пероксидаз- ной активности экстракта хрена.

500 мг измельченного на терке хрена гомогенизируют в ступке, растирая с равным объемом битого стекла с дробным прибавлением 5 мл 5 мМ фосфатного буфера, рН 7,0. Полученную смесь центрифугируют при 5 тыс.об/мин в течение 5 мин, Супернатант разбавляют в 10 раз. Для анализа в 1 см - кювету вносят 0,2 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,0, по 0,2 мл 5мМ гваякола и 5 мМ п-аминодиэтиланилина, 0,2 мл разведенного экстракта хрена. Объем доводят водой до 3,8 мл и реакцию начинают прибавлением 0,2 мл 2 мМ Н202. Через 30 с измеряют прирост оптической плотности раствора при 670 нм за 1 мин на приборе ФЭК КФК-2МП (в кинетическом режиме) при комнатной температуре. Расчет ведут по формуле

д АР/мин К-п

05

со

о

-sj

00

v

n

V

где Д D/MJIH - прирост оптической плотнстсти за 1 мин , К - калибровочный коэффициент (т.е. количество мкмоль HjgO в 4 мл пробы, соответствующее оптической плотности 1)| разведение перед внесением пробы в реакционную смесь, объем вносимой пробы, мл.

В конкретном случае ДБ/мин 0,26 К 0,35} n 10; V 0,2. Тогда А 4,56 мкмоль/минмл 0,0456 мкмоль /мин мг влажной массы хрена.

Пример 2. Анализ пероксидаз ной активности очищенного препарата пероксидазы хрена (RZ 2,7).

Раствор фермента в воде разбавляют до концентрации 0,25-4мкг/мл и анализ осуществляют по примеру 1.

Исходная концентрация фермента 0,5 мг/мл, разбавление 250, объем вносимой пробы фермента 0,2 мл. ADg7()/MHH 0,195. Тогда А 85 мкмол /мин-мл 170 мкмоль/мин мг

В предыдущих примерах активность определялась в кинетическом режиме, т.е„ прямым измерением прироста оптической плотности за 1 мин. Если соответствующие приборы отсутствуют, в серийных опытах активность перокси дазы можно измерять в режиме определения абсолютной величины оптической плотности растворов (против контроля предварительно инкубируя пробы в фиксированное время (5 - 30 мин) при комнатной температуре по формуле, мкмоль/мин-мл:,

А

АР-П-К V-t

где t - время инкубации, мин. Остальные параметры аналогичны примеру 1.

Пример 3. Анализ следов гемоглобина по его пероксидальной активности.

Непосредственно перед опытом смешивают 0,2 мл 1 М ацетатного буфера, рН 5,3, 0,2 т 5 мМ гваякола, 0,2 мл 5 мМ п-аминодиэтиланилина, 0,2 мл разведенной исследуемой пробы (4- 40 мкг гемоглобина). Объем проб доводят до 2,8 мл водой и реакцию начи

5

0

нают прибавлением 0,2 мл 20 мМ П„0„. После инкубации проб при комнатной температуре реакцию останавливают прибавлением 1 мл 0,125 М Na2HPO. и пробы фотометрируют при 670 нм (ФЭК КФК-2МЩ 1 см) или 650 нм (СФ-26, 1 см) против контроля (без гемоглобина). Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по раствору гемоглобина с известным содержанием этого гемового белка.

Допустимые граничные значения концентраций хромогенов приведены в табл.1 о Условия: 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,0. Концентрация пероксидазы хрена (Реанол, RZ 0,6) 0,5 мкг/мл, перекиси водорода 0,1 мМ. ФЭК КФК-2МП; 670 нм, 1 см.

Таблиц

1

Как видно кз табл.1, максимальный положительный эффект предлагаемого способа достигается при концентрации хромогенов 0,25-0, 75 мК При концентрации больше 0,75 мМ чувствительность анализа не растет, однако увеличивается оптическая плотность контроля.

Чувствительность анализа увеличивается в 5,6 раза.

Сравнение чувствительности определения пероксидазы хрена по предлагаемому и известному методам (хромоген - гваякол) дано в табл.2.

Условия: 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,0. Концентрация хромогенов 0,25 мМ. перекиси водорода 0,t мМ, фотоэлектроколориметр ФЭК (2МП, 1 см. Температура 20еС. Пероксидаза хрена (Реанол, RZ 0,6).

0,005 0,124 0,251 0,372 0,492 0,834

О

0,022 0,045 0,066 0,087 0,198

Способ определения пероксидазной активности биологических объектов

путем добавления к исследуемой пробе буферного раствора, перекиси водорода и хромогена и инкубации с измерением прироста оптической плотности во времени, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве хромогена используют смесь гваякола и п-аминодиэтиланилина при

концентрации каждого компонента 0,25-0,75 ммоль.

Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения пероксидазной активности в биологических образцах и в иммунофермент- ном анализе. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, перекись водорода и в качестве хромогена смесь гваякола и п-аминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,25-0,75 мм. Пробу инкубируют, измеряя прирост оптической плотности во времени. Способ позволяет повысить чувствительность определения пероксидазной активности в 5,6 раз. 2 табл.