Способ получения целлюлазы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/42 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения целлюлолитичес- ких ферментов, дрожжевой и грибной биомассы, и может быть использовано в медицинской и микробиологической промышленности, а также в сельском хозяйстве.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа и улучшение качества конечного продукта.

На фиг. 1 изображена схема, поясняющая способ; на фиг. 2-4 - графики активности целлюлазы; на фиг. 5 - типичные хроматограммы.

Способ осуществляют следующим образом.

Синтез целлюлазы проводят на ере- де, содержащей ферментолизат целлюло- эосодержащего сырья. При этом с целью устранения ингибирования синтеза целлюлазы глюкозой (т.е. эффект ката- болитной репрессии) на ферментолиза- те предварительно выращивают дрожжи, которые затем удаляют, В ферментоли- зате остаются неусвоенные дрожжами целлодекстрины и метаболиты дрожжей, которые играют роль ростовых факторов для гриба - продуцента целлюлазы. Продуцент выращивают на целлодекстри- нах, при этом образуется свободная

о

Ј

с&

от остатков субстрата пищевая грибная биомасса, а в культуральной жидкости - целлкшаза. Часть целлюлазы .используют как товарный продукт, a часть (5-20%) - на приготовление фер- ментолизата. Ферментолиэат р целью инактивирования целлюлозы и прекращения дальнейшей деградации целло- декстринЪв до глюкозы прогревают

при 70°С.

В качестве целлюлозосодержащих отходов используют макулатуру, волокнистый материал отстойников бумажных фабрик, хлопковый линь, отхо- ды текстильной промышленности - пух фильтровой, подметь серая, подметь масляная, вискозная рвань. Такие отходы являются нелигнифицировэнной целлюлозой и не нуждаются в предва- рительной делигнифнкации.

В качестве грибов - продуцентов целлголазы используют следующие штаммы:

Trichoderma lignorum OM534A

JTrichodertna viride QM9414 Trichoderma lignoruffi 60 Trichoderma lignoruffi QM6A Trichoderma Roningii sp. Trichoderma lignorum 19

Trichoderma viride ЙГ-14 Б качестве микроорганизмов, усваивающих глюкозу из ферментолизата целлюлозосодержащих отходов, исполь™ зуют любые виды дрожжей, способные к росту на глюкозе. Однако, учитывая что оптимум рН получения, ферментолизата с помощью целлюлазы грибов рода Trichoderraa составляет 4,8-5,0, наиболее целесообразно применение дрожжей вида Kluveromyces (Saccha- romyces) fragilis, которые имеют тот же оптимум рН для роста биомассы. Это позволяет не корректировать рН при выращивании дрожжей на ферменто- лизате; избежать бактериального заражения дрожжевой биомассы в процессе нестерильного культивирования. Схема,поясняющая способ (фиг. 1),

включает блок 1 корректировки рН и питательных компонентов среды 2, аппарат 3 ферментативного гидролиза целлюлозесодержащего сырья с транспортирующим устройством 4 и транспортирующим устройством 5 для отвода не прогидролизовэнного остатка, аппарат 6 для культивирования дрожжей с транпортирующим устройством 7 для отвода товарных пищевых дрожжей, аппарат 8

0

5

Q

0

0

5

для культивирования грибов с транспортирующим устройством 9 для отйода грибной биомассы и аппарат-распределитель 10 для целлюлазы, с транспортирующим устройством 11, транспортирующие устройства 12-17 для подачи в аппараты 3, 6 и 8 нужных питательных сред игкомпонентов, а также подачи обрабатываемых сред соответственно в аппараты 6 и 8 и аппарат- распределитель 10.

Способ получения целлюлазы и микробной биомассы осуществляют следующим образом.

Целлюлозосодержалще отходы по транспортирующему устройству 4 поступают в аппарат 3. В этот же аппарат по транспортирующему устройству 12 подается из аппарата-распределителя tO в нужном количестве культуральная , жидкость, содержащая целлншазу, а по транспортирующему устройству 14 подают воду, питательные компоненты, в случае необходимости кислоту, напри- мер фосфорную НдРОф, щелочь, например гидроокись аммония NH,OH. Эти компоненты перемешивают в аппарате 3 до образования в нем раствора, содержащего питательные компоненты следующего состава, %: азотнокислый аммоний NH4N03 0,7-1,0; фосфорнокислый однозамещенный калий КНгР04 0,3-0,5; сульфат магния M,gS04 7Н2О 0,05. При этом рН раствора доводят до 4,5-5,0.

В аппарате 3 происходит осахарива- ние целлюлозосодержащего сырья, так как целлюлаза, содержащая полноценный комплекс гидролитических ферментов, гидролизует целлюлозу с образованием глюкозы, целлобиозы и целло- декстринов различной степени «полимеризации. При достижении концентрации глюкозы в пределах 1-3% раствор, являющийся ферментативным гидролизатом, содержащим компоненты минерального питания, прогревают в течение 10 мин до 70°С и направляют из аппарата 3 в аппарат 6 по транспортирующему устройству 15 на дальнейшую .обработку. Непрогидролизованный остаток из аппарата 3 выводят по транспортирующему устройству 5,

В аппарат 6 по транспортирующему устройству 18 подают посевной материал для выращивания биомассы, например дрожжи Klvfverornyctjs fragilis в количестве 57 от объема среды.

Дрожжи культивируют до полного по- .глощения из среды глюкозы (максимального синтеза биомассы дрожжей). В периодическом процессе культивирование дрожжей Kluveromyces /ragilis проводят в течение 20-24 ч при 24-26 С и аэрации в количестве 100-125 объемов на 1 объем культуральной среды в 1 ч Дрожжи усваивают из ферментативного гидролизата глюкозу и част элементов минерального питания, при этом в аппарате 6 накапливается биомасса дрожжей Kluveromyces fragilis и растворимые внеклеточные метаболиты дрожжей. По окончании процесса ферментации в аппарате 6 биомассы дрожжей отделяют: фильтруют, сепарируют, уплотняют и так далее (не показано), выводят из аппарата 6 по транспортирующему устройству 7 и ис- прльзуют в качестве пищевой белковой биомассы. Культуральная жидкость из этого аппарата транспортирующим устройством 16 подается в аппарат 8 для дальнейшей обработки.

Кроме того, в аппарат 8 из блока 1 транспортирующим устройством 13 подают фосфорную кислоту (или ее водный раствор) с целью коррекции рН до 4,8-5,0, а по транспортирующему устройству 19 подают посевной материал культивируемых микрогрибов, например, рода Trichoderma в количестве 5-8% от объема среды.

В аппарате 8 при культивировании грибов рода Trichoderma под действием находящихся в среде индукторов - целлобиозы и целлодекстринов образуется целлюлаза и одновременно накапливается грибная биомасса. При этом растворимые внеклеточные метаболиты дрожжей Kluveromyces fragilis служат ростактивирующими факторами для микрогрибов. Гриб рода Trichoderma культивируют до максимального синтеза целлюлазы. В периодическом процессе культивирование гриба проводят в течение 24-48 ч при 30-55° С и аэрации в количестве 45-60 объемов воздуха на объем культуральной среды в 1 ч. По окончании процесса ферментации биомассу гриба отделяют от культуральной среды и по транспортирующему устройству 9 выводят из аппарата 8 для дальнейшей обработки и использования в качестве белкового товарного продукта (уплотнение, фильтрация, сушка, упаковка).

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Из аппарата 8 в аппарат-распределитель 10 по транспортирующему устройству 17 поступает культуральный фильтрат, который в аппарате-распределителе 10 разделяют на два потока. Один поток транспортирующим устройством 11 выводится из аппарата-распределителя 10 на дальнейшую технологическую обработку: сгущение, сушка, очистка и другое (не показаны) с целью получения товарной целлюлазы, а второй поток направляется транспортирующим устройством 12 для осуществления процесса гидролиза целлю- лозосодержащих отходов в аппарат 3. Способ получения целлюлазы и товарной микробной биомассы предусматривает при необходимости стерилизацию питательной среды, поступающей в аппарат 8. Технологическая схема может быть реализована как в периодическом, так и в непрерывном процессе. В последнем случае посевной материал вносят лишь на стадии пуска.

Пример. Посевной материал гриба - продуцента целлюлаэы Trichoderma lignorum OM534 (коллекция Института микробиологии АН БССР) выращивают в пробирках на косом агаре, поверх которого помещают стерильные полоски фильтровальной бумаги. Для приготовления косяков используют среду состава, г: NaNO, 5,0; 4,0; MgS0.7H20 0,5; агар 20; водопроводная вода 100 мл. Жидкую питательную среду засевают смывом 14-суточной культуры из расчета 50 мл стерильной воды на 1 пробирку с посевной культурой и 10 мл суспензии используют для засева 100 мл среды.

В колбу со 100 мл среды помещают 2 г фильтровальной бумаги и культивируют в течение 4 сут до достижения активности целлюлазы 1,5-2,0 ед. На фиг. 2 показаны изменения при культивировании активности целлюлаз по фильтровальной бумаге (кривая 1), активности целлюлаз по растворимой целлюлозе (кривая 2) и рН культуральной среды (кривая 3).

Грибную биомассу отфильтровывают через нейлоновую ткань, а культу- ральную жидкость подкисляют фосфорной кислотой до рН 4,8-5,0 и центрифугируют с целью удаления взвешенных частиц. Затем к 5 г целлюлозы добавляют 100 мл раствора целлюлазы (культуральной жидкости) и выдерживают в течение 1-2 ч при 40°С. При этом- происходит распад целлюлозы до целлодекстринов, целлобиозы и глю- . козы. Непрогидролизованный остаток отфильтровывают, а ферментелизат, с целью инактивации целлюлаз - нагре- вают до 70°С и выдерживают 10 мин, На фиг. 3 показана термостабильность целлюлаз ы (прогрев в течение 5 мин). В результате предотвращения дальнейший гидролиз целлодекстринов до более низкомолекулярных соединений и глюкозы,

С целью контроля углеводного состава аликвоту фермектолизата упари- вают на роторном испарителе или в вакуум-сушильном шкафу в 5-10 раз, отфильтровывают и фильтрат наносят на бумажную хроматограмму, которую элюируют в восходящем потоке в системах изопропанол:вода 1:1,6 и этил- ацетатапиридин:вода-4,1:0,5. Хрома- то граммы проявляют 1%-ным раствором солянокислого п-анидизина в этаноле или щелочным раствором AgNO.

На фиг. 5 показаны типичные хро- матограммы: а - макулатура, гидролизов анная культуральным фильтратом Т. lignorum ОМ534; б - гидролизат после выращивания на нем дрожжей К. fragilis; в - культуральный фильтрат К, fragilis после выращивания на нем гриба Т. lignorum OM534} г - свидетели (А - целлобиоза, В - глю- кбза, Б - арабиноза, F - ксилоза, Х- целло декстрины).

Целлюлаза Т. lignorum OM534 образует смесь глюкозы, целлодекстринов, арабинозы, ксилозы, неидентифицированный сахар и следы целлобиозы, поскольку обладает значительной целло- биазной активностью (фиг, 5 а).

Для- удаления глюкозы из ферменто- лизата на нем выращивают дрожжи К. (Sacch.) fragilis (коллекция Института микробиологии АН БССР).

Дрожжи К. fragilis выращивают в пробирках на скошенном сусло-агаре. В качестве посевного материала используют смыв 3-суточной культуры дрожжей из расчета 10 мл стерильной , воды на 1 пробирку с посевной культурой и 10 мл суспензии используют для засева 100 мл ферментолизата.

Дрожжи выращивают на круговой качалке 200 об/мин при 28tfC в течение 1,5-2 оут, после чего суспензию центрифугируют, а в культуральной

жидкости контролируют содержание редуцирующих веществ и хроматографически состав углеводов (фиг, 56).,

с Выращивание на ферментолизате дрожжей К. (Sacch.) fragilis снижает содержание глюкозы, арабинозы и ксилозы до следовых количеств. Неутилизируемой остается фракция целлодекIQ стринов (фиг. 56). Однако выращивание на ферментолизате культуры Т.lignorum приводит к усвоению целлодекстринов (фиг. 5в), а также снижению количества редуцирующих веществ в

j 5 среде.

Культуральную жидкость с целло- декстринами стерилизуют при 1,5 атм в течение 30 мин. После охлаждения разливают в колбы Эрленмейера по

2Q 100 мл и засевают каждую 10 мл суспензии спор гриба Trichoderma lignorum ОМ534, Гриб культивируют в течение 3 еут до получения максимальной активности целлюлазы 1,5-2,0 ед. Ди25 намика синтеза целлюлазы Т. lignorum ОИ534 на среде с целлодекстринами показана на фиг. 4. Биомассу гриба, не содержащую нерастворимого субстрата, отфильтровывают, а часть культураль30 ной жидкости (целлюлазы) используют для получения новой порции ферментолизата. При этом цикл повторяется.

35

50

Формула изобретения

1. Способ получения целлюлазы, включающий приготовление питательной среды для гриба - продуцента целлюлазы, глубинное культивирование на пи40 тательной среде, содержащей источник целлюлозы, подвергнутый гидролизу, гриба - продуцента целлюлазы рода Trichoderma и дрожжей Saccharomyces, отличающийся тем, что, с

«с целью расширения функциональных возможностей способа и улучшения качества конечного- продукта, при приготовлении питательной среды для гриба - продуцента целлюлазы источник целлюлозы подвергают ферментативному гидролизу с помощью целлюлазы, в полученном ферментолизате инактивируют целлюлазы прогреванием и осуществляют последовательное глубинное культивирование дрожжей и гриба - проду цента целлюлаз, причем дрожжи культивируют до полного истощения в культуральной среде моносахаридов, удаляют их и культивируют на полученной

Формула изобретения

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения целлюлолитических ферментов, дрожжевой и грибной биомассы, и может быть использовано в медицинской и микробиологической отраслях промышленности, а также в сельском хозяйстве. Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа и улучшение качества конечного продукта. Способ осуществляют следующим образом. Синтез целлюлазы проводят на среде, содержащей ферментолизат целлюлоз о со держащего сырья. При этом с целью устранения ингибирования синтеза целлюлазы .глюкозой на ферменто- лизате предварительно выращивают дрожжи, которые затем удаляют, ферментолизате остаются неусвоенные дрожжами целлодекстрины и метаболиты дрожжей, которые играют роль ростовых факторов для гриба - продуцента целлюлазы. 2 з.п.ф-лы, 5 ил. tf С

-Q

S

з,о

QJ 3.

2,0

«о

§

M.O

к

С „I

ч

х

Г 9,0

I

-S

7,0

/5.0 Вл с

Но

CD

Ко&

J S. 3 4 5 6 7

Продолжительность культиЬироЬьния, сут1

Фи,г.2

3,0

i

ю мпературо .З

О

Iй I

20

ft

0

Риг.

о

@Г 6

Л