Способ отбора регуляторов роста растений цитокининовой и ауксиновой природы Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 A01N65/00 

Изобретение относится к физиологии растений и может быть использовано для поиска гормоноподобных регуляторов роста растений, использование которых является перспективным направлением химизации сельского хозяйства.

Целью изобретения является упрощение и увеличение производительности процесса отбора регуляторов роста цитохининовой и ауксиновой природы.

П р и м е р 1. Получение коньюгата зеатина с белком и антизеатиновой сыворотки.

3,6 мг зеатинрибозида и 2,25 мг перио- дата калия растворяют в 1 мл дистиллированной воды и выдерживают при комнатной температуре. 20 мг белка растворяют в 1 мл дистиллированной воды и прибавляют по каплям к раствору зеатинрибоэида. рН доводят до 9,5 5%-ным раствором соды. Добавляют 11,25 мг и смесь оставляют в холодильнике на 18 ч. Затем рН доводят муравьиной кислотой до 5,5 и оставляют смесь на 1 ч, после чего раствором аммиака доводят рН до 8,5.

Антисыворотку к зеатину получают путем введения кроликами внутримышечно

о

&

о ел

Јь

1 мг конъюгатй . Oc-iko, с 0,5 мл полного адъювама Фрейнда Повторные иммунизации с интервалом в две недели проводят в течение spex месяцев вм же количеством иммуногеча, смешанного с 0,5 мл неполною эдыованта Фрейнда Через неделю после последней иммунизации собирают от каждого кроликь мо 20 мл крови. Титры антисыворогсж МО&ОО по резуль- iaT3N . Оценка Л/РОК нянооои активное / гзерцоФпзным иммуно рмент IM енали- зом(ТФИФА)

Исследуют ряд щчгчв различной природы, среди которых ззрсшые цитокини ноподобш к-i ре у я ;, эы роста, Конъю1аг зеатинпиГхзпл I lii -Ьензш зминолурин- р и боз и да I БД (р б. ч. i г.й, с о за я ьЬ у г и н or разводя и 0,05 № HP, оийкарбпнэтном буфере рЧ 9,7 оачлие с- г аждуо лунку , олм- стиролового пла петз выде иваю1г з течение 1, -эй о70| (срна боялгяция) При этом происходит сорбция коььюги- ровапного гормон/ з на полисгироловый план шел Поспе пропь а лунок физиологическим jaciBoooM, сод8р,кающи | 0,ОЬ% Тьинз-20 разлит toi i луГ1ки сыворотку, развртечную в П э ря чтворо содерха- щем 0,В% овчлабу MI: R яд лунок ллгот по )0 i.;; от1- Hoof Rome.в различчс1 имрслн: зсо нрибо мд KWH« i IH, чи ./ibi- иопуркк, одсь,н .1 i,oio3S IMH, изонечто- н ладе- .ич, fi nrtsnajf ячн, кикетчн, зэлтин, аденоз i, АБК

/ огуст/ .-ый диапазон копцентраций регуляторов рос i: оюрып пггояоЗуют постановке , 1-10 мкг/ыл (концентрация в гунке гн г Ч1|ета

Инкубг цик1 г|1 сво 1чг в гоек ti 1 j чри 37°С Посл дооа яс1ют дчслко- стичесгкир мгитО|.( им.у.юглобулк нов фо;.кэ, fOnon e иор.эчсыдрзии разведенные в фм гол гачес1. , содорхащо 0,15V -ча-20 п, % гзаяь- бумина (ФТО) Пос-к3 промыв, ч Ллзнологи- (ом, соде( . ги.и 0,05% Твина-20(Ф Г), цобЈвляютсуСг: р т опенки активности перо № 131ы (0,4 мг мл 1 ортофенияендмамичо в 0,06 fv1 оосфэтпом буфере рН 5,8} ог11- - с ie чего появляется окраска Через 30 мин реакцию огтангвли- вают дсбавлеччем О 1 ivjn & и серной мн лоты. Инт8нсис,ос1ь краикм измеряют на спечгрсфо омефе тч 9 нм.

Поглощенно о чункг-ч, 15 ко г jpbte добав ляют веществ, t озвниеают с помещением в лунсэх удР |фо-1ч , ничего не добавляю 3 иостоверноо ингпбирооамме связывания (йммунорязк явность) принимают оптической плотности IQ- nee чем на 20% по cpsr -. с контре лем.

Биотест на цитокининовую активность.

Семена щирицы Amarantus caudatus L. раскладывают на смоченную водой фильтровальную бумагу в чашки Петри и проращивают в течение 72 ч в термостате в темноте при 24°С. Затем на рассеянном свету у проростков отделяют корешки и раскладывают на 10 шт. в чашки Петри диаметром 6 см на фильтровальную бумагу, смоченную 2 мл 1/75 М фосфатного буфера (рН 6,3). содержащего 1 мг/мл тирозина и вещества, исследуемого на цитокининовую активность ПО мг/л) Чашки инкубируют в темноте прм 24°С. После 18 ч инкубации амаратин экстрагируют 0,1 н HCI (2мя). Концентрацию амарантина определяют спектоофотометрически при 540 нм. Значение ЭКСТИРКЦИИ контроля (без исследуемо- вощества) принимают за 100%. Увеличение &КСТИНКЦИИ раствора более,чем на 20%, по сравнению с контролем свидетельствует о цигокининовой активности исследуемого вещества

В табл 1 определение цитоки- ниновойактивное.и соединений.

Как видно из )абл. 1 цитокининоподоб- пые вещества проявляют иммунореактив- ость, а не обладающие цитокининовой активностью - нет. Таким образом, с помощью ТФИФА можно отбирать вещества с гормоноподобной активностью по их имму- иореактивности в отношении специфической сызоротки к гормону (в данном примерз к цитокинину зеатину).

П р и м е р 2. Получение коньюгата иидолилуксусной кислоты (14УК) с белком.

Растворяют 50 мг ИУК в 1 мл безводного диоксана, добазлчют 50 мг дициклогексил карбодимица, раствор встряхивают в течение 30 мин при комнатной температуре, затем по каплям, пеоемешивая, добавляют к 10 мл 0 1 М боратного буфера рН 8,5, содержащего 100 мг белка. Раствор оставляют на ночь в холодильнике, затем очищают от несвязавшегося ИУК диализом против 0,01 М боратного буфера рН 8,0, Антисыворотку получают так же, как и для цитокининов.

Оценка аукоиновой активности в ТФИФА

Условия проведения анализа те же, что ч в примере 1 Отличие заключается лишь в том, что сенсибилизацию проводят конъю- гатом ИУ|( с овальбумином и используют соответствующие антитела к ИУК. ,Среди веществ, которые подвергнуты анализу, в отличие от примера 1 взято больше ауксин- подобных веществ (известные ауксинподоб- ные гербициды).

Биотест на ауксиновую активность.

Семена пшеницы Альбидум 43 замачивают в воде на 18 - 24 ч (при 24°С в термостате), затем раскладывают на фильтровальной бумаге, обильно смоченной водой. Кюветы сверху закрывают стеклами и помещают в термостат при 25°С на двое суток. Из трехдневных колеоптилей пшеницы выбирают колеоптили оптимальной длины 18 - 20 мм или 20 - 22 мм. Из отборных колеоптилей вырезается средняя часть. После удаления первого настоящего листа отрезки колеоптилей нанизывают по 10 шт. на тонкие стеклянные спицы и помещают в исследуемые растворы (10 мг/л). Период инкубации растворов 18 - 20 ч. Затем каждый отрезок колеоптилией в отдельности промеряют на миллиметровой бумаге и вычисляют среднюю величину отрезка. Увеличение длины отрезков более, чем на 20% по сравнению с контролем, свидетельствует об ауксиновой активности исследуемого вещества.

В табл. 2 показано определение ауксиновой активности соединений.

Как видно из табл. 2 ауксиноподобные вещества реагируют с сывороткой к ИУК, а не обладающие ауксиновой активностью, не реагируют. Из примера 2 видно, что по иммунореактивности вещества (т.е. по способности его реагировать с сывороткой) можно отбирать аукеинподобные вещества.

П р и м е р 3. Исследование способности веществ, отобранных с помощью антисыворотки к зеатину в ТФИФА, повышать выживаемость растений после подсушивания (тест на засухоустойчивость).

Биологические испытания проводят на растених пшеницы сорта Симбирка (сред- неустойчивого к засухе). Семена в течение трех часов замачивают в растворе исследуемого вещества в концентрациях 0; 0,1; 1 и 10 мг/л. В качестве контроля берут вещества, не способные реагировать с антисывороткой к зеатину.

Затем семена раскладывают на стекло, покрытое фильтровальной бумагой, и помещают в кюветы с дистиллированной водой, проращивают е термостате при 24°С. Через трое суток кюветы с растениями переносят на светоплощадку. На седьмые сутки после начала проращивания отбирают по 50 одинаковых проростков каждого варианта, отделяют зерновки и осторожно отрезают

корни с тем, чтобы не повредить меристема- тическую ткань. Затем проростки подсушивают в термостате при 24°С, пока потеря от исходной массы растений не составляет

около 70%. После этого растения раскладывают на фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой, в кюветы, покрытые стеклом, выдерживают на свету в течение семи суток. К концу этого срока подсчитывэют количество выживших растений (регенерировавших корневую систему).

Результаты испытания веществ на зе- атиновую i активность г представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что замачивание семян в растворах веществ, способных реагировать с антителами к зеатину, приводит к увеличению количества растений, выживших после подсушивания. Таким образом,

вещества, отобранные с помощью антисыворотки к цитокинину зеатину (подобно другим веществам, обладающим цитокини- новой активностью), повышают устойчивость растений к засухе. Результаты опыта

свидетельствуют о том, что предлагаемый способ отбора позволяет обнаружить вещества, которые могут найти применение как регуляторы засухоустойчивости.

Способ отличается надежностью, позаоляет с достаточной легкостью анализировать одновременно десятки образцов, отличается небольшой трудоемкостью и длительностью, время проведения отбора сокращается с нескольких суток до полозины рабочего дня,

Формула изобретения

Способ отбора регуляторов роста расте- ний цитокининовой и ауксиновой природы, включающий контактирование испытуемых соединений с сайтами рецепции гормонов и последующую оценку по активности взаимодействия, отличающийся тем. что. с целью упрощения и увеличения производительности процесса отбора, в качестве сайтов рецепции цитокининов и ауксинов используют соответственно специфические антитела, полученные при иммунизации животных конъюгатами зеатинэ и индо- лилуксусной кислоты с белком, а оценку проводят твердофазным иммунофермент- ным методом.

Таблица Л

Изобретение относится к области физиологии растений и может быть использовано для поиска гормоноподобных регуляторов роста растений, использование которых является перспективным направлением химизации сельского хозяйства. Целью изобретения является упрощение и увеличение производительности процесса отбора регуляторов роста цетокининовой и ауксиновой природы. Способ заключается в контактировании испытуемых соединений со специфическими антителами к гормонам, полученным при иммунизации животных конъюгатами гормонов с белком. Антитела в данном случае рассматриваются как модели рецепто.рных сайтов гормонов, а их способность взаимодействовать с испытуемым соединением оценивают твердофазным иммуноферментным методом (ТФ ИФА). Исследуемое вещество и раствор гормона (эталон) приводят в контакт с полученными антителами к гормону. Затем сравнивают способность тестируемых веществ и эталона ингибировать связывание антптеп к гормону, конъюгированному с белком и иммобилизованному на полистироле. Количество антител, сорбированных на иммобилизованном гормоне, оценивают с помощью твердофазного иммунофермент- ного анализа. 3 табл. W Ё

Производные аденина

Зеатин

Зеатинрибозид

б Бензиламинопурин

Изопентениладенин

Кийетим

Аденин

Аденозин

Анозинфосфат

Аденоэинциклофосфат

Аденозиндифосфат

Абсцизовая кислота

Индолилуксусная кисло

Цитокининовая активность в биотестах

+ + + +

4+ + + + +

Таблица 2

Таблица 3