Способ обнаружения веществ с цитокининовой активностью Советский патент 1993 года по МПК G01N33/534 A01N65/00 

ел С

Использование: биотехнология, регуляция роста растений, выявление веществ, обладающих цитокининовой активностью. Сущность изобретения: воздействуют испытуемым веществом на тест-объект, определяют цитокининзависимый параметр по сравнению с контролем. В качестве тест- объекта используют фракцию выделенных из растений злаков предварительно очищенных водорастворимых белков в количестве 0,02-0,5 мг/тест в смеси с высокомечеными цитокининами с радиоактивностью 10000-100000 расп/мин на тест. 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и регуляции роста растений и может быть использовано для выявления веществ, обладающих цитокининовой активностью, необходимых для практики современного растениеводства и для научных исследований.

Целью изобретения является повышение чувствительности и объективности, а также сокращение длительности и трудоемкости испытаний веществ на цитокинино- вую активность.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе, включающем воздействие испытуемого вещества на тест-объект в виде целых растений или их изолированных органов и последующую оценку результата по сравнению с контролем, в качестве тест-объекта используют определенное количество фракции растворимых белков из вегетативных органов злаков в смеси с меченым цитокинином, в соотношении 100- 1000 расп/мин радиоактивности гормона на 1 мкг белка. Для воздействия испытуемого вещества на тест-объект достаточно 5 мин при 0-20°С и рН 6-9. Оценку эффекта ведут по содержанию меченого цитокинина. ассоциированного с белками, после их выделения из тест-системы по сравнению с контролем. Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного использованием в качестве тест-системы фракции растворимых белков злаков, обладающей способностью специфически взаимодействовать с цитокининами. В научно-технической и патентной литературе, посвященной поиску новых цитокининов, этот признак ранее не описан. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию новизна. Что касается антител, используемых для иммунологического определения

00

о

00

К) 00

00

содержания эндогенных цитокининов, то они обладают узкой специфичностью и интенсивно взаимодействуют лишь с тем соединением (и его близким аналогом), против которого они были выработаны (3). Поэтому тест-система на основе антител не подходит для обнаружения новых веществ с цитоки- ниновой активностью.

Фракция природных белков из вегетативных частей злаков обладает необходимыми свойствами, позволяющими создать на ее основе тест-систему для поиска новых цитокининов. Во-первых, эти белки взаимодействуют с широким спектром различных цитокининов, включая цито- кинины как аденинового ряда, так и производные дифенилмочевины, Во-вторых, указанные белки отличаются высокой стабильностью и не меняют своих свойств по ходу очистки и в процессе тестирования. Полученная белковая.фракция может длительно храниться без изменения основных характеристик в соответствующих условиях, например, в замороженном растворе при (-29)-(-70)°С, в виде осадка в растворе 75-80% от насыщения сульфата аммония при температуре от 0°С и ниже, а также в лиофильно высушенном виде.

Заявленный способ осуществляют следующим образом. Для получения тест- объекта смешивают в любой последовательности микрообъемы препарата белка в количестве 0,02-0,50 мг на тест с 0,2-5,0 пикомолями высокомеченого цитокинина с удельной радиоактивностью не ниже 100 ГБк/моль, для получения нужного количества радиоактивности в пробе. Затем к пробам добавляют испытуемое вещество и в качестве одного из наиболее удобных осадителей белка сульфат аммония до конечной концентрации 2,5-3,5 М, перемешивают, выдерживают 5-15 мин при рН 6-9 и 0-20°С, быстро отделяют образовавшийся осадок и определяют его радиоактивность.

Предлагаемые диапазоны условий тестирования установлены экспериментальным путем и отражают основные свойства цитокининсвязывающих компонентов используемой фракции растворимых белков злаков. Выход за указанные границы рН и температуры приводит к быстрому исчезновению цитокининсвязывающей активности тест-объекта и тем самым к инактивации тест-системы в целом. Отход от рекомендуемых параметров количественных соотношений белка и меченого гормона приводит к существенному уменьшению диапазона количественного определения цитокинино- вой активности и/или может вызвать значительный перерасход компонентов тест-системы.

Пример 1.В опыте используется фракция растворимых белков листьев ячменя, очищенная дробным высаливанием сульфатом аммония, в количестве 0,5 мг белка на тест. Температуру системы поддерживают вблизи 20°С, рН 7,5. В качестве радиоактивного лиганда используют меченый тритием зеатин с удельной радиоактивностью 95 ГБк/ммоль и в количестве 35000 расп/мин на Тест. Испытуемым веществом служит природный цитокинин зеатин, рас, творенный в 20% этаноле в воде. В конт

5 рольные пробы добавляют равный объем чистого, растворителя. При добавлении в тест-систему зеатина в количестве 1,6 мкг и осаждении белков после 10 мин инкубации наблюдается более чем двукратное умень0 шение радиоактивности белкового осадка по сравнению с контролем.

Результаты этого (пример 1) и других опытов представлены в виде сводной таблицы, где показано сравнение результатов оп5 ределения для цитокининов (примеры 2-6) и иных соединений (примеры 7-10). На чертеже показана калибровочная кривая определения одного из представителей цитокининов дигидрозеатина. График де0 монстрирует возможность количественного определения цитокининовой активности в широком диапазоне концентраций этих биорегуляторов.

Вся процедура от момента подготовки

5 тест-объекта до получения готового результата может быть выполнена в течение 1 ч, Эта методика дает возможность проводить серийный анализ веществ -до сотни и более за смену - в строго идентичных условиях.

0 Чувствительность способа была установлена в опытах с использованием очищенной фракции растворимых белков из листьев ячменя и меченого тритием дигидрозеатина с удельной радиоактивностью

5 около 900 ГБк/ммоль в качестве меченого лиганда. Результаты показали, что минимальная концентрация немеченого дигидрозеатина, которая может быть количественно определена, составляет при0 мерно 0,3 пикомоля, что для данной тест- . системы соответствует всего 66 пикограмм этого фитогормона. Тем самым предложенный способ позволяет повысить чувствительность определения цитокининов по

5 сравнению с традиционными биотестами не менее чем на 3-4 порядка при существенном увеличении надежности определения. Предлагаемый способ не представляет опасности для здоровья персонала и для окружающей среды, так как рассчитан на

использование индикаторных микродоз одного из самых мягких изотопов - трития, находящегося на всех этапах тестирования в вИде нелетучего соединения в разбавленном водном растворе. В связи с подбором условий хранения, при котором растворимые белки злаков не теряют своих полезных свойств, возможен централизованный выпуск препарата этих белков для обнаружения веществ с цитокининовой активностью.

Таким образом, замена физиологических тест-систем на биохимическую выгодно отличает предложенный способ от прототипа тем, что в связи с высокой чувствительностью позволяет анализировать микроколичества веществ; значительно повышает скорость определения до 100 и более раз; позволяет проводить испытание сразу большого количества веществ до сотни и более за смену в строго идентичных условиях; исключает метаболизацию исследуемого вещества и тем самым позволяет определить его собственную цитокинино- вую активность; повышает объективность испытаний в связи с однородностью тест-объекта; дает возможность проводить испытания круглогодично независимо от сезона года; позволяет проводить

испытания непосредственно на химических предприятиях без привлечения специалистов-биологов; дает возможность более точно классифицировать соединения по их цитокининовой активности в данной системе и унифицировать процедуру испытаний.

Формула изобретени я

Способ обнаружения веществ с цитокининовой активностью, заключающийся в том, что на те,ст-объект воздействуют испытуемым веществом, а затем определяют ци- токининзависимый параметр по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и достоверности способа, в качестве тест-объекта используют фракцию очищенных водорастворимых белков, выделенных из растений злаков, а количество 0,02-0,5 мг/тест, в смеси с мечеными цитокинина- ми с радиоактивностью 10000-100000 расп/мин на тест, воздействие осуществляют не менее 5 мин при температуре 0-20°С и рН 6-9, в качестве цитокининзависимого параметра определяют радиоактивность выделенных меченых цитокининов, ассоциированных с вышеуказанными белками.

Продолжение таблицы

Степень очистки обозначена цифрами: 1 - фракционирование сульфатом аммония; 2 - то же, что 1 плюс гель-хроматография; 3 - то же, что 2 плюс ионообменная хроматография.

ИУК - индолилуксусная кислота

1

-2

-1,5

-1

Редактор Л.Волкова

Немеченый, дагидроэееглн,- log нмоль Составитель Г.Романов Техред М.МоргенталКорректор О.Кравцова

Продолжение таблицы

-0.5

0.5

.1

1.5