СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА Советский патент 1995 года по МПК C07K14/56 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для использования в медицинской и микробиологической промышленности для производства альфа-2 интерферона человека.

Целью изобретения является повышение степени очистки и удешевление целевого продукта.

Для этого осуществляют следующие процедуры.

1. Разрушение клеток методом лизиса в лизатном буфере, содержащем 15-20% сахарозы и ингибиторы протеиназ при рН 7,5-8,2 и 3-5^оС.

2. Удаление нуклеиновых кислот и нерастворимых компонентов и клеток полиэтиленимином при конечной концентрации 0,25-0,35%
3. Фракционирование белков сернокислым аммонием при 70-85%-ном насыщении и рН 7,2-7,9.

4. Фракционирование нерастворимых белков гидрофобной хроматографией на сорбенте с привязанными фениловыми группами фенилсилохроме С-80.

5. рН-фракционирование белков 35% -ной ортофосфорной кислотой до рН 4,5-5.

6. Концентрирование и диафильтрация раствора белков.

7. Фракционирование раствора белков ионообменной хроматографией на сорбент-целлюлозе DE-52.

8. Фракционирование раствора белков ионообменной хроматографией на сорбенте-целлюлозе СМ-52.

9. Концентрирование раствора белков.

10. Гель-фильтрация раствора белков на сорбенте-сефадексе G-100.

Все операции проводят в стерильных условиях с использованием апирогенных сорбентов и буферных растворов.

П р и м е р 1. 1.1 Лизис клеток.

4268 г замороженной при -70^оС биомассы Pseudomonas putida VG-84 продуцента альфа-2 интерферона человека дробят механически на куски объемом 1-2 см³, загружают в реактор, добавляют 21340 мл лизатного буфера (0,1М трис-НСl, 15% сахарозы, 5 мМ ЭДТА, 0,2 М хлористого натрия, 10 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,005% тиодигликоля, рН 7,9) и при 4^оС перемешивают в течение 1 ч. Лизированные клетки центрифугируют в течение 1 ч на центрифуге Бэкман δ2-21 при скорости 10000 об/мин. Получают 22100 мл внутриклеточного экстракта белков.

1.2. Обработка полиэтиленимином.

К полученному внутриклеточному экстракту белков добавляют 1140 мл 5%-ного раствора полиэтиленимина до конечной концентрации 0,25% и перемешивают в течение 1 ч. Суспензию центрифугируют в течение 30 мин в роторе А-10 центрифуги при скорости 10000 об/мин. Супернатант собирают, получают 23200 мл раствора.

1.3. Фракционирование сернокислым аммонием.

К полученному супернатанту в реакторе (объем 50 л) добавляют соль сернокислого аммония до 85% -ного насыщения при контролируемом рН 7,2-7,9 (подкисление) и перемешивают в течение 2 ч. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в 16000 мл 0,025 М фосфатного буфера (рН 7,1) с 3 М хлористого натрия. Получают 19400 мл раствора нативного интерферона альфа-2 интерферона человека.

1.4. Гидрофобная хроматография на фенилсилохроме С-80.

Полученный раствор белков подвергают хроматографическому разделению в колонке с 3000 мл фенилсилохрома С-80, уравновешенной 0,025 М фосфатного буфера с 3 М хлористого натрия при рН 7,1. Фракцию альфа-2 интерферона человека элюируют пропусканием 0,025 М фосфатного буфера (рН 7,1), а весь процесс с этой стадии проводят в стерильных условиях.

1.5. рН-фракционирование.

К полученному раствору белков (12400 мл) в реакторе (объем 20 л) добавляют 35% -ную ортофосфорную кислоту до рН 4,75. Перемешивают 1 ч. Суспензию центрифугируют в течение 30 мин в роторе δA-10 центрифуги δ2-21 при 10000 об/мин. Собирают надосадок (11920 мл).

1.6. Концентрирование и диафильтрация раствора белков.

Концентрирование и диафильтрацию раствора белков проводят с применением кассеты фильтров с пределом пропускания 10000 дальтон, на системе типа "Pelicon". После концентрирования до объема 1200 мл добавляют 2000 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 8). Проводят 6 циклов диафильтрации. Конечный концентрат объемом 1200 мл имеет рН 8.

1.7. Ионообменная хроматография на целлюлозе DE-52.

Полученный раствор белков подвергают хроматографии в колонке с 4300 мл целлюлозы, уравновешенной 0,01 М фосфатного буфера при рН 8. Фракцию альфа-2 интерферона человека элюируют пропусканием 0,05 М ацетатного буфера (рН 5).

1.8. Ионообменная хроматография на целлюлозе СМ-52.

Полученный раствор белков 3200 мл подвергают хроматографическому разделению в колонке с 3000 мл целлюлозы, уравновешенной 0,1 М ацетатным буфером при рН 5.

Фракцию альфа-2 интерферона человека элюируют пропусканием линейного градиента 0,1 М ацетатного буфера и 0,1 М ацетатного буфера с 0,4 М хлористого натрия (рН 5). Скорость элюции 2 л/ч.

1.9. Концентрирование раствора белков.

Концентрирование раствора белков проводят с применением кассеты типа РТGC с пределом пропускания 10000 дальтон на системе типа "Minitan" до конечного объема 400 мл.

1.10. Гель-фильтрация через сефадекс G-100.

Полученный раствор белков подвергают гель-фильтрации со скоростью 300 мл/ч в колонке К 100/100 с 7500 мл сефадекса, уравновешенной 0,1 М фосфатным буфером с добавлением 0,2 М хлористого натрия (рН 7,2). Объединяют фракции. Выход гомогенного альфа-2 интерферона человека составляет 13,1% при активности целевого продукта 1,45 х 10¹⁰ МЕ.

П р и м е р 2. 2.1. Лизис клеток проводят по примеру 1.1.

2.2. Обработку полиэтиленимином проводят по примеру 1.2.

2.3. Фракционирование сернокислым аммонием проводят по примеру 1.3.

2.4. Гидрофобную хроматографию проводят по примеру 1.4.

2.5. рН-фракционирование проводят по примеру 1.5 до рН 4,5.

2.6. Концентрирование и диафильтрацию проводят по примеру 1.6.

2.7. Ионообменную хроматографию на целлюлозе DЕ-52 проводят по примеру 1,7, используя для элюции 0,06 М ацетатный буфер (рН 4,8).

2.8. Ионообменную хроматографию на целлюлозе СМ-52 проводят по примеру 1.8, используя для элюирования линейный градиент 0,1 М ацетатного буфера и 0,1 М ацетатного буфера с 0,5 М натрия хлористого (рН 4,8).

2.9. Концентрирование проводят по примеру 1,9.

2.10. Гель-фильтрацию через сефадекс G-100 проводят по примеру 1.10, используя 0,05 М фосфатный буфер с 0,25 М хлористого натрия (рН 7,25). Выход целевого продукта 12,6% с активностью 1,9 х 10¹⁰ МЕ.

П р и м е р 3. 3.1. Лизис клеток проводят по примеру 1.1.

3.2. Обработку полиэтиленимином проводят по примеру 1.2.

3.3. Фракционирование сернокислым аммонием проводят по примеру 1.3.

3.4. Гидрофобную хроматографию проводят по примеру 1.4.

3.5. рН-фракционирование проводят по примеру 1,5 до рН 5.

3.6. Концентрирование и диафильтрацию проводят по примеру 1.6.

3.7. Ионообменную хроматографию на целлюлозе DЕ-52 проводят по примеру 1.7, используя для элюировании 0,04 М ацетатный буфер (рН 5,2).

3.8. Ионообменную хроматографию на целлюлозе СМ-52 проводят по примеру 1,8, используя для элюирования линейный градиент 0,1 М ацетатного буфера и 0,1 М ацетатного буфера с 0,3 М хлористого натрия (рН 5,2).

3.9. Концентрирование проводят по примеру 1.9.

3.10. Гель-фильтрацию через сефадекс G-100 проводят по примеру 1.10, используя 0,15 М фосфатный буфер с 0,15 М хлористого натрия (рН 7,15).

Активность полученного альфа-2 интерферона составляет 1,65х10¹⁰ МЕ.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения гомогенного альфа-2 интерферона человека медицинского назначения. Данный способ предназначен для использования в медицинской и микробиологической промышленности для производства альфа-2 интерферона человека, необходимого в медицине для лечения различных вирусных заболеваний, а также как препарат для комбинированного лечения. Целью изобретения является повышение степени очистки и удешевление целевого продукта. Способ заключается в разрушении биомассы бактериального продуцента Pseudomonas putida 84, содержащего рекомбинантную плазмиду pVG-3. В лизатном буфере pH-фракционирование проводят при рН 4,5-5, концентрирование и диафильтрацию - через кассету фильтров типа PTGC с пределом 1000° дальтон, хроматографию осуществляют на целлюлозе DE -52 с использованием для элюирования 0,04-0,06 М ацетатный буфер (рН 4,8-5,2) на целлюлозе СМ-52 с элюированием линейным градиентом 0,1 М ацетатного буфера и 0,1М ацетатного буфера с 0,3-0,5 М хлористого натрия (рН 4,8-5,2), а гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100, уравновешенном 0,05-0,15 М фосфатным буфером с 0,15-0,25 М натрия хлористого (рН 7,15-7,25).

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, включающий лизис клеток микроорганизмов Pseudomonas putida, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование, концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование, гель-фильтрацию на сефадексе G-100, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки и удешевления продукта, рН-фракционирование проводят при рН 4,5 5, концентрирование и диафильтрацию проводят с помощью кассеты фильтров типа PTGC с пределом 10000 дальтон, после хроматографии на целлюлозе DE-52 элюцию проводят 0,04 0,06 М ацетатным буфером при рН 4,8 5,2, а после хроматографии на целлюлозе СМ-52 элюируют линейным градиентом 0,1 М ацетатного буфера и 0,1 М ацетатного буфера с 0,3 0,5 М хлористого натрия при рН 4,8-5,2, концентрирование проводят через кассету типа PTGC с пределом 10000 дальтон и гель-фильтрацию осуществляют на сефадексе G-100, уравновешенном 0,05 0,15 М фосфатным буфером с 0,15 0,25 М хлористого натрия при рН 7,15 - 7,25.