Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и фармакологии, касается способа получения рекомбинантных белков, обладающих терапевтической активностью и модифицированных за счет присоединения альбумина человека, включающего технологию культивирования штаммов-продуцентов и последующую очистку целевых белков. Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того факта, что гибридные белки, содержащие альбумин плазмы крови человека, присоединенный к целевому белку, обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как более продолжительное время полужизни, что улучшает качество жизни пациентов (Yeh P et al. Proc. Natl. Acad.Sci. 1992. V.89. P.1904-1908; Smith B. et al. Bioconjugate Chem. 2001. V.12. P.750-756; Halpem W. et al. Pharm. Res. 2002. V.19. P.1720-1729). Активную часть гибридного белка могут представлять белки различной природы, которые обладают биологической активностью, позволяющей использовать их в качестве лекарственных средств. Например, это могут быть ферменты, ингибиторы ферментов, гормоны, интерфероны и интерлейкины. Получение модифицированных интерферонов и интерлейкинов, обладающих широким спектром активностей, особенно актуально.
Известны способы получения рекомбинантных белков, модифицированных альбумином человека, из дрожжей Kluyveromyces lactis (патент US 6,686,179, опубликованный 3 февраля 2004), дрожжей Saccharomyces cerevisiae (патент US 7,045,318, опубликованный 16 мая 2006), бактерий, дрожжей Saccharomyces cerevisiae и клеток млекопитающих (патент US 6,946,134, опубликованный 20 сентября 2005; патент US 6,994,857, опубликованный 7 февраля 2006; патент US 7,238,667, опубликованный 3 июля 2007). Бактерии как прокариотические организмы не способны осуществлять посттрансляционную модификацию белков, характерную для эукариотических организмов, а вследствие условной патогенности прокариотических штаммов - продуцентов - рекомбинантные белки могут содержать примеси эндотоксинов, поэтому длительное применение рекомбинантных белков бактериальной природы сопровождается нежелательными побочными эффектами (Primrose S.B. J. Appl. Bacteriol. 1986. V.61. P.99-116; Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии, 1996). Системы экспрессии, созданные на основе культуры клеток млекопитающих, позволяют получать аутентичные гетерологичные белки. Существенным недостатком этих систем является сложность работы с культурами клеток и трудоемкость получения трансгенных растений и животных, что увеличивает стоимость получаемых рекомбинантных белков.
Недостатком системы экспрессии дрожжей К.lactis и S.cerevisiae является использование экспрессионных плазмид, содержащих гены устойчивости к антибиотикам, что создает опасность горизонтального переноса. Кроме того, белки, секретируемые этими дрожжами, гипергликозилированы, что сопровождается изменением их физико-химических свойств (Schultz L.D. et al. // Gene. 1987. V.54. P.I 13-123; Eckart M.R., Bussineau C.M. // Curr. Opin. Biotechnol. 1996. V.7. P.525-530).
Этих недостатков лишена система экспрессии дрожжей Pichia pastoris. Использование в качестве продуцентов метилотрофных дрожжей Pichia pastoris дает возможность существенно повысить выход рекомбинантных белков и избежать гипергликозилирования секретируемых гетерологичных белков (Cereghino J.L., Cregg J.M. FEMS Microbiol.Rev. 2000. V.24. P.45-66). Накопление рекомбинантных белков в культуральной жидкости значительно упрощает процедуру их очистки. Однако выход конечного продукта во многом зависит от используемой технологии культивирования штамма-продуцента, выделения и очистки рекомбинантного гибридного белка.
Известен способ получения рекомбинантных белков, модифицированных альбумином человека, из дрожжей К. Lactis (патент US 6,686,179, опубликованный 3 февраля 2004), наиболее близкий к заявляемому способу, выбранный в качестве прототипа. Известный способ заключается в культивировании при 30°С рекомбинантного штамма дрожжей в питательной среде, обеспечивающей рост клеток и синтез целевого белка, удалении клеток, ультрафильтрации и последующем диализе культуральной среды, аффинной хроматографии на сорбентах типа Blue-Trisacryl, двухстадийной ионообменной хроматографии на сорбентах типа S Sepharose FF или Q Sepharose FF, диализе.
Недостатками известного способа являются его многостадийность и низкая технологичность, что ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства рекомбинантных гибридных белков.
Техническим результатом заявляемого способа является упрощение и повышение эффективности технологии очистки целевого белка за счет нового способа культивирования дрожжей - продуцентов, обеспечивающего продукцию целевого белка, обладающего биологической активностью, сопоставимой с немодифицированными белками, что позволяет получать биологически активные гибридные белки, пригодные для создания на их основе лекарственных препаратов, а также создает возможность промышленного производства рекомбинантных гибридных белков.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения рекомбинантных белков, модифицированных присоединением альбумина человека, из культуральной жидкости дрожжей, включающем культивирование штаммов дрожжей в питательной среде, обеспечивающей рост клеток и синтез целевых белков, удаление клеток, концентрированно среды, осаждение целевого белка и его очистку с использованием гель-фильтрации и аффинной хроматографии, в соответствии с заявленным способом культивируют штаммы дрожжей Pichia pastoris, которые являются продуцентами гибридных белков (альбумин-интерлейкин-2 человека и альбумин-альфа 16-интерферон человека), культивирование проводят в модифицированной среде, стадию индукции синтеза целевого белка проводят при 20-25°С, очистку проводят осаждением целевого белка при 75% насыщения сульфата аммония или 25% полиэтиленгликоля 3350, гель-фильтрацией на сорбенте типа Сефакрил HR 200 или BioRad P-300 и аффинной хроматографией на Cibacron F3GA. При этом концентрирование культуральной среды осуществляют с использованием мембраны АР-0.3-50ПС.
Кроме того, указанный технический результат достигается тем, что гель-фильтрацию на сорбенте типа Сефакриле HR 200 или BioRad P-300 проводят с использованием в качестве уравновешивающего и элюирующего раствора 20 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,5.
Помимо этого указанный технический результат достигается тем, что аффинную хроматографию на Cibacron F3GA проводят с использованием в качестве уравновешивающего раствора 20 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,5; отмывку осуществляют последовательным использованием уравновешивающего буферного раствора и уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,5 М хлористого натрия, элюцию целевого белка проводят градиентом концентрации тиоцианата калия 0,5-1,0 М в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5 или 50 мМ трис-HCl, рН 7,5-8,5.
В заявленном способе указанный технический результат достигается таким образом путем использования рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris PS106(pPIC9HAbIL-2) - продуцента гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека, ранее полученного авторами предлагаемого изобретения (решение о выдаче патента от 23 апреля 2007 по заявке RU 2006110098), и штамма дрожжей Р. pastoris PS106 (pPIC9HAbIFNa-16), полученного способом, ранее заявленным авторами предлагаемого изобретения (решение о выдаче патента от 23 апреля 2007 по заявке RU 2006110098) - продуцента гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека, культивировании штаммов в модифицированной питательной среде и индукции синтеза целевого белка, удалении клеток, концентрировании культуральной среды, осаждении целевого белка сульфатом аммония или полиэтиленгликолем (ПЭГ) 3350, гель-фильтрации на сорбентах типа Сефакрил HR 200 или BioRad Р-300, аффинной хроматографии на сорбентах типа Cibacron F3GA.
Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения целевых гибридных белков являются следующие:
- культивирование штаммов - продуцентов в модифицированной среде BMGY, содержащей 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 6,0;
- индукция синтеза целевого белка при 22-25°С в модифицированной среде ВММ, содержащей 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 6,0;
- концентрирование культуральной среды с использованием мембраны АР-0.3-50ПС;
- осаждение целевого белка при 75% насыщения сульфата аммония или 25% полиэтиленгликолем (ПЭГ) 3350;
- растворение полученного осадка, содержащего целевой гибридный белок в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5;
- проведение гель-фильтрации на сорбентах типа Сефакриле HR 200 или BioRad P-300 в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5;
- проведение аффинной хроматографии на сорбентах типа Cibacron F3GA с использованием в качестве уравновешивающего раствора 20 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,5; удаление примесных белков 0,5 М хлористым натрием в уравновешивающем буфере, проведение элюции целевого белка градиентом концентрации тиоцианата калия 0,5-1,0 М в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5 или 50 мМ трис-HCl, рН 7,5-8,5.
Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:
- использование в качестве продуцентов гибридных белков штаммов дрожжей Р. pastoris PS106(pPIC9HAbIL-2) - продуцента гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека и PS106(pPIC9HAbIFNa-16) - продуцента гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека;
- культивирование штаммов дрожжей в модифицированной среде BMGY, содержащей 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 6,0;
- проведение стадии индукции синтеза целевого белка при 20-25°С в модифицированной среде ВММ, содержащей 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 6,0, что позволяет получать более высокий выход гибридных белков;
- последовательное использование стадий ультрафильтрации и осаждения целевого белка сульфатом аммония или полиэтиленгликолем (ПЭГ) 3350, приводящее к значительному уменьшению объема обрабатываемой культуральной среды на первых стадиях очистки, что имеет большое значение при масштабировании процесса производства целевых белков;
- двухстадийная хроматографическая очистка гибридных белков на сорбентах типа Сефакрил HR 200 или BioRad P-300 и Cibacron F3GA, позволяющая получать биологически активные гибридные белки.
Сущность и преимущества заявленного изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Культивирование штаммов дрожжей Р. pastoris - продуцентов гибридных белков альбумин-интерлейкин-2 и альбумин-альфа 16-интерферон. После этого брали 1 мл суспензии дрожжей Р. pastoris PS106 (pPIC9HAbIL-2) - продуцента гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека или PS106 (pPIC9HAbIFNa-16) -продуцента гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека, хранящейся в 15% глицерине при -70°С, вносили в 50 мл модифицированной среды BMGY (табл.1), в которой по сравнению со стандартной средой концентрация калий-фосфатного буфера в 2 раза меньше, и культивировали при 30°С на качалке с перемешиванием (200-220 об/мин) в течение 24-36 часов до достижения оптической плотности ОD600 от 2,5 до 4,0, предпочтительно 3,0. Затем 25 мл полученного инокулята переносят в 1 литр модифицированной среды BMGY и культивируют в 1,6 л ферментере Bioflo III (New Brunwick Sci. Co) при 30°С с перемешиванием (230-450 об/мин) в течение 68-72 часов до полной утилизации глицерина. Затем стерильно собирают клетки центрифугированием при 6-7 тыс.об/мин в течение 15 минут, при +4°С и переносят в 1 л модифицированной среды ВММ, которая в отличие от среды BMGY в качестве единственного источника углерода содержит метанол. При добавлении метанола происходит индукция синтеза целевого белка. Концентрация метанола поддерживается в интервале от 0,5% до 2,0%, предпочтительно от 0,75 до 1,0%. Культивирование на стадии индукции проводят при 20-25°С, предпочтительно при 22°С, в течение 96-120 часов, предпочтительно 100-110 часов. Продукцию целевого белка тестируют при помощи электрофореза белков культуральной жидкости в редуцирующих условиях. Уменьшение концентрации неорганического фосфата за счет использования модифицированной среды способствует повышению продукции гибридных белков.
Анализ белков, секретируемых штаммами-продуцентами, показал, что снижение температуры на стадии индукции до 20-25°С позволяет предотвратить протеолитическое расщепление целевых белков и тем самым повысить их выход.
Пример 2. Очистка гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека. По окончании процесса культивирования клетки дрожжей удаляли центрифугированием при 6-7 тыс.об/мин в течение 15 минут, при +4°С. Все последующие операции проводили при температуре +4°С. Надосадочную жидкость пропускали через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Millpore Inc.).
Полученный таким образом фильтрат концентрировали на ультрафильтрационной установке УПЛ-0,6 с использованием мембраны АР-0.3-50ПС (НПК «Биотест», Кириши), отсекающей соединения с молекулярной массой менее 50 кДа, на этой стадии происходило удаление низкомолекулярных компонентов среды и уменьшение исходного объема до 100-200 мл. Затем проводили солевое осаждение целевого белка, доводя насыщение сульфата аммония до 75%. Осадок целевого белка собирали центрифугированием при 12-14 тыс.об/мин в течение 20 минут. Полученный осадок растворяли в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, и наносили на колонку, содержащую 280 мл BioRad P-300, уравновешенного этим же буфером. Первые 75 мл отбрасывали, фракции, содержащие целевой белок, объединяли. На этой стадии происходило освобождение от основной массы примесей.
Полученный таким образом элюат наносили на колонку, содержащую 2,5 мл аффинного сорбента Cibacron F3GA, уравновешенного 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,5. Отмывали колонку последовательно 10 мл уравновешивающего буфера и 10 мл уравновешивающего буфера, содержащего 0,5 М хлористого натрия. Элюцию проводили градиентом концентрации тиоцианата калия от 0,5 М до 1,0 М в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5 или 50 мМ трис-HCl, рН 7,5-8,5. На этой стадии удаляли остаточные примесные белки, которые являлись продуктами протеолиза альбумина, входящего в состав гибридного белка.
Электрофорез в редуцирующих условиях показал, что использование данной схемы очистки позволило получить препарат гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека, содержание примесей в котором не более 5%. Молекулярная масса гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека составила примерно 86 кДа. Средний выход из литра культуральной среды составлял 7-9 мг.
Пример 3. Очистка гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека. По окончании процесса культивирования клетки дрожжей удаляли центрифугированием при 6-7 тыс.об/мин в течение 15 минут, при +4°С. Все последующие операции проводили при температуре +4°С. Надосадочную жидкость пропускали через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Millpore Inc.).
Полученный таким образом фильтрат концентрировали на ультрафильтрационной установке УПЛ-0,6 с использованием мембраны АР-0.3-50ПС (НПК «Биотест», Кириши), отсекающей соединения с молекулярной массой менее 50 кДа, на этой стадии происходило удаление низкомолекулярных компонентов среды и уменьшение исходного объема до 100-200 мл. Затем осаждали целевой белок ПЭГ 3350 при 25% насыщения. Осадок целевого белка собирали центрифугированием при 12-14 тыс.об/мин в течение 20 минут. Полученный осадок растворяли в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, и наносили на колонку, содержащую 200 мл Сефакрила HR 200, уравновешенного этим же буфером. Первые 60 мл отбрасывали, фракции, содержащие целевой белок, объединяли. На этой стадии происходило освобождение от основной массы примесей.
Полученный таким образом элюат наносили на колонку, содержащую 2,5 мл аффинного сорбента Cibacron F3GA, уравновешенного 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,5. Отмывали колонку последовательно 10 мл уравновешивающего буфера и 10 мл уравновешивающего буфера, содержащего 0,5 М хлористого натрия. Элюцию проводили градиентом концентрации тиоцианата калия от 0,5 М до 1,0 М в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5 или 50 мМ трис-HCl, рН 7,5-8,5. На этой стадии удаляли остаточные примесные белки, которые являлись продуктами протеолиза альбумина, входящего в состав гибридного белка.
Электрофорез в редуцирующих условиях показал, что использование данной схемы очистки позволило получить препарат гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека, содержание примесей в котором не более 5%. Молекулярная масса гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека составила примерно 82,0 кДа. Средний выход из литра культуральной среды составлял 6-7 мг.
Пример 4. Исследование биологической активности гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека.
Биологическую активность очищенного гибридного белка тестировали по его способности подавлять цитопатическую активность вируса везикулярного стоматита в первичной культуре L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, чувствительной к интерферонам альфа-типа (Liu P.T. et al. // Protein Expres. Purif. 2001. V.22. Р.381-387). В качестве стандарта использовали человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-28-90-87 (ГИСК, Москва).
Культуру клеток L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека выращивали в питательной среде Игла MEM, содержащей 2 мМ L-глутамина, 10% сыворотку плодов коров и антибиотики (пенициллин и стрептомицин, по 100 ед/мл) при (36,0±1,0)°С. После формирования монослоя клетки снимали со стекла смесью Версена и трипсина в соотношении 1:1 (ФС 42-65 ВС-93; ФС 42-3321-96), смесь Версена и трипсина сливали, клетки суспендировали в питательной среде Игла MEM, содержащей L-глутамин и антибиотики (пенициллин и стрептомицин, по 100 ед/мл), но без сыворотки плодов коров в концентрации 150-300×103/мл. По 200 мкл подготовленной взвеси клеток вносили в 96-луночные планшеты и инкубировали при (36,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% СО2 в течение 48-72 часов до образования полного монослоя. Удаляли питательную среду, вносили в лунки по 100 мкл серии двукратных разведений испытуемого препарата и стандарта и инкубировали при (36,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% CO2 в течение 24 часов. Затем в каждую лунку с испытуемым препаратом и стандартом вносили дозу вируса везикулярного стоматита штамма «Индиана» (депонированный в коллекции ГИСК, per №11/82), соответствующую 100 ТЦД50/0,1 мл, и инкубировали при (36,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% СО2 в течение 24 часов. Противовирусную активность испытуемого препарата вычисляли по формуле:
Ax=(Астанд/aстанд)×aх,
где Ax - противовирусная активность испытуемого препарата в МЕ/мл;
Астанд - противовирусная активность стандарта в МЕ/мл;
ax - титр испытуемого препарата (величина, обратная разведению);
астанд - титр стандарта (величина, обратная разведению).
Удельная активность очищенного препарата гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека составила 0,4-1,7×107 МЕ/мг. Учитывая, что молекулярная масса альфа 16-интерферона человека - 20 кДа, а молекулярная масса альбумина - 66 кДа, доля активного компонента - альфа 16-интерферона человека в молекуле гибридного белка составляет примерно 23%. Исходя из этого, можно заключить, что присоединение альбумина не приводит к существенному снижению биологической активности альфа 16-интерферона человека, которая составляет 0,3-1,0×108 МЕ/мг (RU 2203950, опубликованный 10 мая 2003).
Пример 5. Исследование биологической активности гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека.
Биологическую активность очищенного гибридного белка тестировали по его способности обеспечивать пролиферацию интерлейкин-2-зависимых Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 (Gearing A.J.H., Thorpe R. // J. Immunol. Meth. 1988. V.I 14. P.3-9). В качестве стандарта использовали BRMP reference reagent human IL-2 (NCI, США).
Т-лимфоциты мыши линии CTLL-2 суспендировали в питательной среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ L-глутамина и антибиотики (пенициллин и стрептомицин, по 100 ед/мл), 10% сыворотку плодов коров, в концентрации 1×106/мл и вносили в 96-луночные планшеты, в которые перед этим вносили по 100 мкл серии двукратных разведений испытуемого препарата и стандарта. Планшеты инкубировали при (36,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% СO2 в течение 42 часов. После этого в каждую лунку вносили 10 мкл 0,005% раствора тиазолина голубого (МТТ) в среде RPMI 1640 без добавок и инкубировали 6 часов при (36,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% СO2. В жизнеспособных клетках, стимулированных интерлейкином-2 в составе гибридного белка, образовывались нерастворимые в водных растворах темно-синие кристаллы формазана. Планшеты центрифугировали в течение 5 минут при 2000 об/мин, удаляли из лунок супернатан, добавляли по 100-200 мкл диметилсульфоксида, встряхивали до полного растворения кристаллов формазана и измеряли поглощение при длинах волн 540 нм и 690 нм. Активность испытуемого препарата определяли сопоставлением значений поглощения испытуемого препарата и стандарта.
Удельная активность очищенного препарата гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека составила 1,4-2,2×105 МЕ/мг. Учитывая, что молекулярная масса 0-гликозилированного рекомбинантного интерлейкина-2 человека - 16,0 кДа (Vita N. et al. Lymphokine Res. 1990. V.9. P.67-79), а молекулярная масса альбумина - 66 кДа, доля активного компонента - альфа 16-интерферона человека - в молекуле гибридного белка составляет примерно 20%. Исходя из этого, можно заключить, что присоединение альбумина не приводит к снижению биологической активности альфа 16-интерферона человека, которая составляет 1,0×106 МЕ/мг (RU 2140283, опубликованный 27 октября 1999).
Таким образом, заявляемый способ получения рекомбинантных белков, модифицированных за счет присоединения альбумина человека, включающий технологию культивирования штаммов-продуцентов и последующую очистку целевых белков, позволяет получать целевые белки, обладающие биологической активностью, сопоставимой с немодифицированными белками. Принимая во внимание тот факт, что гибридные белки, содержащие альбумин человека, присоединенный к целевому белку, обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, можно заключить, что на основе очищенных гибридных белков: альбумин-интерлейкин-2 человека и альбумин-альфа 16-интерферон человека могут быть получены эффективные препараты для лечения различных вирусных заболеваний (Guo J.T. et al. J. Virol. 2001. V.75. Р.8516-8523; Попович A.M. Интерлейкин-2: иммунобиология и иммунотерапия. 2004; Siebeck N. et al. Am. J. Vet. Res. 2006. V.67. P.1406-1411; Human Genome Sciences Reports. 2007), онкологических заболеваний (Borden E.C. Oncologist. 1998. V.3. P.198-203; Bukowski R.M. Semin. Oncol. 2000. V.27. P.204-212; Молчанов О.Е. и др. Современные тенденции иммунотерапии злокачественных опухолей. 2001) и аутоиммунных заболеваний человека (Piskova J. et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2006. V.47. P.3946-3950).
Заявленный способ по сравнению с мировыми аналогами имеет более простую схему выделения целевых белков и более высокую эффективность за счет предотвращения протеолиза целевых белков, что позволяет получать биологически активные гибридные белки, пригодные для создания на их основе лекарственных препаратов с улучшенными фармакокинетическими свойствами для лечения заболеваний различной этиологии, а также возможность получения целевых белков в промышленном масштабе.
Изобретение относится к области биотехнологии. Конкретно к способу получения рекомбинантного белка альбумин-интерлейкин-2 человека или рекомбинантного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека, модифицированного за счет присоединения альбумина человека. Способ включает технологию культивирования штамма дрожжей Pichia pastoris PS106/pPIC9HAbIL-2 или штамма дрожжей Pichia pastoris PS106/pPIC9HAbIFNa-16 в модифицированной питательной среде BMGY. После чего проводят индукцию синтеза целевых белков при пониженной температуре. Далее проводят удаление клеток и концентрирование среды. Затем используют осаждение целевых белков сульфатом аммония или полиэтиленгликолем 3350. Потом выделяют целевые белки гель-фильтрацией на сорбентах типа Сефакрил HR 200 или BioRad Р-300. И в заключение проводят аффинную хроматографию на сорбенте типа Cibacron F3GA. Данное изобретение позволяет упростить и повысить эффективность технологии очистки целевого белка, а также позволяет получать биологически активные гибридные белки, пригодные для создания на их основе лекарственных препаратов. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.
1. Способ получения рекомбинантного белка, модифицированного присоединением альбумина человека, из культуральной жидкости дрожжей, включающий культивирование штаммов дрожжей в питательной среде, обеспечивающей рост клеток и синтез целевого белка, удаление клеток, концентрирование среды, осаждение целевого белка и его очистку с использованием гель-фильтрации и аффинной хроматографии, отличающийся тем, что культивируют штамм дрожжей Pichia pastoris PS106/pPIC9HAbIL-2 - продуцент гибридного белка альбумин-интерлейкин-2 человека или штамм дрожжей Pichia pastoris PS106/pPIC9HAbIFNa-16 - продуцент гибридного белка альбумин-альфа 16-интерферон человека в модифицированной среде BMGY со сниженной в 2 раза концентрацией калий-фосфатного буфера, стадию индукции синтеза целевого белка проводят при 20-25°С, альбумин-интерлейкин-2 человека очищают путем осаждения 25% полиэтиленгликолем 3350 и выделяют его гель-фильтрацией на сорбенте типа Сефакрил HR 200, а альбумин-альфа 16-интерферон человека очищают путем осаждения при 75% насыщении сульфатом аммония и выделяют его гель-фильтрацией на сорбенте типа BioRad Р-300, в заключение проводят аффинную хроматографию целевого белка на Cibacron F3GA.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гель-фильтрацию на сорбенте типа Сефакрил HR 200 или BioRad Р-300 проводят с использованием в качестве уравновешивающего и элюирующего раствора 20 мМ натрий-ацетатного буфер, pH 5,5.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что аффинную хроматографию на Cibacron F3GA проводят с использованием в качестве уравновешивающего раствора 20 мМ натрий-ацетатного буфер, pH 5,5, при этом отмывку осуществляют последовательным использованием уравновешивающего буферного раствора и уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,5 М хлористого натрия, а элюцию целевого белка проводят градиентом концентрации тиоцианата калия 0,5-1,0 М в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,5 или 50 мМ трис-HCl, pH 7,5-8,5.
| Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков | 1922 |
|
SU6A1 |
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
| Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков | 1922 |
|
SU6A1 |
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
| Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков | 1922 |
|
SU6A1 |
| СКОУПС P | |||
| Методы очистки белков | |||
| Мир, 1985, с.81-82, 146-163, 197-213. | |||
