Способ получения @ - @ -галактозидазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/38 

о эо

ND

00 Изобретение относится к способам получения и очистки ферментных препаратов из микроорганизмов, а именно к -способу получения ферментного препарата р-D- галактозидазы (лактазы (р -D-галактозид галактогидролазы 3.2 1.23 из BactilLus suhtilia. Изобретение может быть использова но в микробиологической промьшшенности для получения иммобилизованной на различных носителях -D-галактози дазы и изготовления ферментных элект родов , предназначенных для контроля за использованием углеродов при куль тивировании микроорганизмов, диагностических иммуноферментных комплексов, для получения препаратов, предназначенных для компенсации лактазной недостаточности у взрослых и детей, для гидролиза лактозы и утилизации побочных продуктов молока. Известно получение препарата /j-галактозидазы из специальнб полученного методами индукции и селекции штамма Escherichia coli, включающее осаждение бесклеточного экстракта сульфатом аммония и последующую гельфильтрацию на сефадексе Г-200 1 Однако E.coli относится к условно патогенным микроорганизмам и поэтому производство препаратов на основе штаммов кишечной палочки нежалательно для микробиологической, медицинской и пищевой промышленности. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является способ получения ft -D-галактозидазы, заключающийся в культивировании продуцента вида Bacillus subtil is на питательной среде, разрушении биомассы, осаждении нуклеиновых кислот из бесклеточного экстракта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония. Способ включает также стадию фракционирования ацетоном и позволяет привести 20-кратную очистку фермента. Удельная активность ( -галактозидазы, изперенная при равна 239 Е/мг белка, выход по активности 33%, по белку 1,6% С2. Недостатком данного способа очис ки является инактивация фермента в процессе фракционирования сульфатом С1ММОНИЯ, ацетоном, следствием чего является низкий выход галактозидазы и недостаточно высокая удельная активность . Цель изобретения - увеличение удельной активности и выхода /5-галактозидазы. Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения li-D-галактозидазы, заключающемуся в культивировании продуцента вида Bacillus aubtilis на питательной сре де, разрушение биомассы, осаждении нуклеиновых кислот из бесклеточного экстракта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония, в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ИБП-101, в процессе выделения в растворы добавляют ионы Мп в концентрации 2 М и дитиотреитол в концентрации 2 . , а после осаждения нуклеиновых кислот фермент стабилизируют пропусканием через ионообменную смолу КБ 51.2. Сущность предлагаемого способа заключается в том, что при получении ферментного препарата /3-галактозидазы путем культивирования продуцента вида В.subtilis на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, разрушения биомассы, центрифугирования гомогената, осаждения из бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот и фракционирования белкового раствора сульфатом аммоний в качестве продуцента используют штамм В.subtil is ИБП-101, перед выделением галактозидазы из аммонийно-сульфатной фракции белков фермент стабилизируют пропусканием через ионообменную смолу КВ-512 и добавлением на всех последующих стадиях в растворы Мп и дитиотреитола, а выделение осуществляют, проводя последовательно ультрафильтрацию, хромотографию на ДЭАЗцеллюлозе и ЛЗАЗ-сефадексе и диализ против ацетатного буфера рН 6,3. i Способ осуществляют следующим образом. Культивирование продуцента В. subtilis ИБП-101 проводят при 31°С глубинным способом в 20 л фермента на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: ч t2H20 27; 0,4; пентон 1,5-; (NH4t2S04 4; СаСе2 0,01; F€504 0,4; дрожжевой экстракт 1; лактоза 20, лимоннокислый натрий (однозамещенный ) 1,9, рН 7,2 в течение 20+2 ч. Биомассу отделяют центрифугированием, клетки промывают 0,85%-м NaCCH ресуспендируют в дистиллированной воде из расчета на 1 г биомассы 2-3 мл воды. Суспензию разрушают ультразвуком и экстрагируют из нее белки 2,3%-м раствором NaCK при перемешивании в течение нескольких часов при , центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин. Удельная активность галактозидазы на этой стадии 1,2-1,4 Е/мг белка. Нуклеиновые кислоты осаждают из супернатанта сульфатом аммония при рН 6,8 до достижения степени насыщения 0,25, а супернатант после диализа обрабатывают ионообменной смолой КБ 51- 2. Использование катионита КБ-51-2 для обработки фракции белков из кле ток В. subtil is приводит к тому, что большая часть портеиназ удаляется из раствора, оставшиеся протеиназы удаляются после осаждения р-галактозидазы сульфатом аммония при степени насыщения 0,75. Удельная активность /3 -галактозидазы в процессе обработки смолой возрастает лишь на 30%, но удаление протеинаэ исключает протеолиз /} -галактозидаз на всех последующих стадиях очистки и таким образом стабилизирует фермент. К 100 мл раствора сульфатной фра дни белков прибавляют 1/5 ч. по объ му набухшей смолы КБ-51- 2 в ivla-форме, уравновешенной О,05М фосфатным буфером (рН 6,71, и оставляют на 1 при при периодическом перемешивании; раствор декантируют и осажда ют из него р, -галактозидазу сульфатом аммония до степени насьвдения 0,75. Удельная активность протеиназ до обработки смолой ЗЕ/мг белка, после обработки смолой и осаждения сульфа том аммония 0,3 Е/мг белка. Удельная активность галактозидаз до обработки КВ-51-2 - 1,4 Е/мг бел ка, после обработки 1,9 Е/мг белка. Фракцию белков, осажденную сульфатом аммония со степенью насыщения 0,75, подвергают ультрафильтрации через полупроницаемые ацетатцеллюлозные мембраны типа УАМ-500 марки Владипор. На этой стадии получают . препарат с удельной активностью 7 Е/мг белка, с выходом по белку 31,4%, по активности 148%. Препарат подвергают хромотографии и рехроматографии на ДЭАЭ-целлюлоза, уравновешенной 0,005М фосфатным буфером (рН 7,4/, содержащим 0,05М NaC, i210 f I-IOJM дитиотреитола и 2-10 - МпСе (буфер А). Элюцию /5-галактозидазы проводят линейным градиентом NaCe 0,05-1М в бу,фере А. Фермент выходит при концент рации NaCe 0,25-0,45. Активные фракции концентрируют и дигшизуют против буфера А. Удельная активность /з -галактозй дазы на этой стадии 23,4 Е/мг белка выход по белку 12,1%, по общей акти ности 190%. Рехроматографию на ДЭАЭ-целлюлоз-е проводят в тех же условиях и получа ют препарат с удельной активностью 198 Е/мг белка, выходом по белку 8, и 220% по активности. Препарат подвергают хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе, уравновешенном 0,05м ацетатным буфером (рН 7,0 содержащим 0,005М NaCf, дитио треитола и 10 М MnCCj (буфер Bf. Элюцию проводят -линейным градиентом л/асе о,005-0,2М в буфере Б. Активные фракции диализуют против буфера Б (рН 6,3, получают препарат /3-галактозидазы с удельной активностью 467 Е/мг белка, выходом по белку 3,0 и 936% по активности. Препарат/}-галактозидазы можно хранить без потери активности в 2,2 М {9астворе сульфата аммония ( рН 6,3 К Активность /1 -галактозидазы определяют с п-нитрофенил-/з-Г-галактопиранозидом в качестве субстрата. За единицу активности (El принимают такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 мкмоль субстрата в минуту при оптимальных условиях. Пример. Культивирование продуцента J5 .Subtilis ИБП-101 проводят при 37°С глубинным способом в Ю-литровом ферменте фирмы КБ на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: пептон 1,5; сульфат аммония 4,0; калий фосфорнокислый ,однозамещенный 27,0; магний сернокислый семиводный 0,4 f кальций хлористый 0,01; железо сернокислое семиводное 0,4; натрий лимоннокислый 1,9; дрожжевой экстракт 1,0; лактоза 50, рН 7,1 в течение 20 ч до достижения стационарной фазы. После завершения ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, трижды отмывают 0,85%-м NaCP и ресуспендируют в трех объемах дистиллированной воды, содержащей 1 10 моль ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота ), и гомогенизируют. Разрушение клеток ультразвуком проводят на ультразвуковом дезинтеграторе Soniprer 150 фирмы MSE порциями по 70 мл в течение 5 мин. Доводят рН до 7,2 0,5 м фосфатным буфером (рН 7,81, и экстрагируют белки при перемешивании в течение нескольких часов при 4°С. После центрифугирования при 16 тыс.оборотах в течение 30 мин из супернатанта осаждают нуклеиновые кислоты сульфатом аммония до степени насыщения 0,25, поддерживая рН 6,8-1 М NaOH. После повторного центрифугирования супернатант. обрабатывеиот ионообменной смолой КБ-51- 2 для удаления протеаз. На каждые 100 мл раствора сульфатной фракции белков прибавляют 1/5 ч по объему набухшей смолы КБ-51-2 в Na-форме уравновешенной 0,05 М К-На-фосфатным буфером (рН 6,7/,-и оставляют на 1 ч при 4с при периодическом перемешивании. Затем раствор де1 антируют и осаждают из него (J-галактозидазу сульфатом аммония до степени насыщения 0,75 поддерживая рН 7,2 1 М NaOH. Полученный осадок отделяют центрифугированыем при 16-18 тыс. оборотах в течение 30 мин и растворяют в 0,05 М К-|4а -фосфатном буфере (рН 7,2/, сод ржаадем 5 «Ю М .Nace , а-Ю- М дитиохраитола и 2ilO M МпС

Затем белковый раствор фильтруют через полупроницаемые ацетатцеллюлозные мембраны типа УАМ-500 марки Владипор, до объема 1/3 от исходного с последующей диафильтрацией в шестикратном объеме к исходному 5-10 М K-Na-фосфатного буфера (рН 7,41, содержащего 510 МаСе, 1 10 дитиотреитола, М-МпСе (буфер Al до объема 1/3 от первоначального.

Полученный препарат подвергают хроматографии и рехроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, уравновешенной буфером А, на колонке 25--300 мм. Элюцию -галактозидазы проводят линейным градиентом NaC6 5-10 -1М в буфере А. Скорость элюции 60 мл/ч, время градиентной элюции 24 ч. Фермент выходит при концентрации NaC 0,25-0,45М. Активные фракции собирают, концентрируют и диализуют против буфера А.

Рехроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе проводят в тех же условиях, но полученные активные фракции концентрируют и диализуют против 0,05 М ацетатного буфера (рН 7,01, содержащего 5-10 NaCE , дитиотреитола и 1-10-5 М МпСе4 (буфер Б/, г дгoтaвливaя к хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе.

Хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе, уравновешенном буфером Б, проводят на колонке 12-600 мм. Элюцию ведут линейным градиентом NaCK 5-10 2-10 М в буфере Б при скорости 30 мл/ч. Активные фракции, выходящие первыми двумя пиками, собирают, концентрируют на полупроницаемой мембране УАМ-300 марки Влащипор или в полиэтиленгликоле мол. массой 40000 до концентрации белка 40 мг/мл и диализуют против буфера Б (рН 6,3/

Препараты /з-галактозидазы хранят в 2,2 М растворе сульфата аммония (рН 6,3) с концентрацией белка примерно 20 мг/мл.

Активность р -галактозидазы определяют с п-нитрофенил- -В-галактопиранозидом в качестве субстрата. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует расцепление 1 мкмоль субстрата в минуту при температуре 37°С и рН 6,3.

Результаты очистки приведены в табл. 1.

П р и М е .. Препараты/J-галактоэйдазы, полученные по вышеописанному способу, но без внесения в растворы Мт и дитиотреитола, выдерживают в течение 15 мин при 41с в 0,1 М (-фосфатном буфере рН 6,3 в присутствии различных солей и 2-меркаптоэтанола и без них. Затем инкут0 бируют в тех же условиях в течение 10 мин с 1,2 мг субстрата - п -нитрофенил-|а-С-галактопиранозида. По окончании инкубации измеряют активность фермента.

Результаты приведены в табл. 1. Результаты опытов показали, что достижение положительного эффекта невозможно без добавления Мп и дитио- треитола,так как полученный фермент Ъёладает крайне низкой удельной ак

0 тивностью (48,6 Е/мгЛ

Добавление к очищенному ферменту ионов Mh и дитиотреитола или 2-меркаптоэтанола активирует фермент, но при этом его активность не достигает

5 значений, характерных для препарата, полученного при добавлении активаторов в процессе вьвделения.

Примерз. Преперат /3-галактозидазы, полученный по описанному спо0 собу, после высаливания сульфатом аммония до степени насыщения 0,75 растворяют в 0,05 М K-Na-фосфатном буфере, содержащем 5-10 Nace, 2 -10- 2-10 М дитиот5 реитола. Активность препарата, полученного на данной стадии при указанных концентрациях и дитиотреитола, равна 13,5 Е/мг, что превышает удельную активность препарата, полуQ ченного при более высоких концентрациях активаторов (.табл. 1 .

Таким образом, предлагаемый способ получения ферментного препарата (5-галактозидазы позволяет избежать

5 инактивации фермента в процессе

очистки вследствие его стабилизации, а предлагаемая схема очистки позво|Ляет повысить удельную активность фермента в два раза по сравнению с

0 лучшими препаратами, увеличить выход по активности в 30 раз и достигнуть 320-кратной очистки. Так как фермент имеет рН оптимум в широком диапазоне (рН 6-9), препарат может быть приме5 нен для приготовления иммобилизованных ферментов с цеЛью последующего использования в практических целях.

Таблица

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ - J) -ГАЛАКТОЗ ИДАЗЫ заключающийся в культивировании продуцента вида Bacillus .иЪtilis на питательной среде, разрушении биомассы, осаждении |нуклеиновых кислот и5 бесклеточного экст 13кта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью увеличения удельной активности и выхода -D-галактозидазы, в качестве продуцента использьтот штамм Bacillus subtilis ИБП-101, в процессе выделения в растворы добавляют июны Мп в концентрации 210 «-1-10 М, дйтиотреитбл в концентрации 2 «10 -110 7М, Щ а после осаждения нуклеиновых кислот U) фермент стабилизируют пропусканием через ионообменную смолу КБ 51-2.

Фракция белков 75%-го насыщения сульфатом аммония Ультрафильтрация, УАМ-ЗОО Хроматография на ДЕД Ецеллюлозе с диализом против 0,005 М К-Ма-фосфатного буфера рН 7,4 1470 34508,0 Рехроматография на ДЕАЕцеллюлбзе с диализом против 0,05 М ацетатного 1040 206880,0 буфера рН 7,0 :Хроматография на ДЕАЕ-се фадексе с диализом про«ив 0,05 М ацетатного 364 170000,0 буфера рН 6,3 32328,6 26 88 о, О 3,492,376,0178,0 7,04,731,4148,0 15,723,4712,1190,0 98,92133,58,61139,0 67,03313,43,0936,0