Способ определения чувствительности организма к пыльцевым аллергенам Советский патент 1991 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии, и может быть использовано в диагностике поллинозов.

Целью изобретения является повышение точности, ускорение и упрощение способа.

Способ выполняется следующим образом.

В суспензию выделенных обычным способом лимфоцитов тимуса крысы вводят последовательно плазму крови исследуемого больного, водный раствор аллергена и водный раствор красителя 4-{п-диметиламино- стирил)-1-метилпиридиния (ДСМ) до его конечной концентрации 0.2-0,7 мкМ. Лимфоциты инкубируют с введенными ингредиентами, после чего исследуют в люминесцентном микроскопе. Подсчитывают количество флуоресцирующих лимфоцитов на каждые 100

клеток в суспензии и при его снижении более чем в 1,5 раза (на 30-70%) по сравнению с контролем (контроль - проба без аллергена), определяют повышенную чувствительность к данному аллергену.

Пример 1. Обычным способом выделяли лимфоциты тимуса крысы. Для этого извлекали тимус крысы, скальпелем делали надрез вдоль органа и препаровальными иглами вытряхивали лимфоциты в раствор Хенкса. Полученную суспензию клеток разливали в лунк и по 0.1 мл в концентрации (10-30) млн/мл. В каждую пробу вводили по 2.0 мкл водного раствора ДСМ (10 мкМ - конечная концентрация в пробе 0,2 мкМ) и по 10 мкл плазмы больного М. (аллергический ринит, конъюнктивит) и раствора одного из пыльцевых аллергенов в конечной

Os

(Л

концентрации 1000 PNH (мл) водные растворы производства Ставропольского НИИ вакцин и сывороток, РМИ 10000. Контрольные пробы - без добавки аллергена или сыворотки. Опытные и контрольные пробы помещали в термостат и инкубировали при 37°С в течение 20 мин, после чего по капле окрашенной суспензии клеток из каждой пробы помещали на предметные стекла, накрывали их покровными стеклами и полученные препараты исследовали в поле зрения люминесцентного микроскопа (Л юмамИ-2, производство ЛОМО, СССР) при возбуждении 405-436 нм. Подсчитывали количество флуоресцирующих лимфоцитов на каждые сто клеток.

Параллельно определяли чувствительность к аллергенам с помощью кожных проб. Оценивали чувствительность к следующим пыльцевым аллергенам: лещины, овсяницы, березы, тимофеевки, ежи сборной, лисохвоста.

Воздействие плазмы крови больного М. на лимфоциты не изменяло соотношения флуоресцирующих и не флуоресцирующих клеток. Аллергены из пыльцы злаковых трав и деревьев также не действовали на лимфоциты. Обработка же лимфоцитов смесью плазмы крови с некоторыми аллергенами изменяло долю флуоресцирующих клеток, так, в случае использования специфических для данного больного аллергенов (по результатам скарификационных кожных проб) доля флуоресцирующих клеток резко снизилась. Аллергены же березы и лещины, к которым больной М. не чувствителен (отрицательные результаты кожных проб), практически не влияли на лимфоциты и в присутствии плазмы его крови. Количественной оценкой реакции служит коэффициент К, который показывает во сколько раз снизилась доля флуоресцирующих клеток по сравнению с контролем. В качестве контрольного образца принимали лимфоциты, обработанные только плазмой. Все специфические аллергены (для больного М.) снизили долю флуоресцирующих клеток более, чем в 1,7 раза, но эффект реакции выражен

по-разному: коэффициент К составил величину от 1,8 до 5,4. Таким образом, предлагаемый способ позволил выявить аллерген из пыльцы лисохвоста, к которому больной М.

наиболее чувствителен (,4).

Пример 2. Аналогичным образом исследовали плазму крови больного С. (бронхиальная астма, атоническая форма). В каждую пробу (0,1 мл клеточной суспензии)

вводили по 7,0 мкл раствора ДСМ (10 мкМ - конечная концентрация в пробе 0,7 мкМ) и по 10 мкл плазмы больного С. и растворов аллергенов. Были оценены пыльцевые аллергены ежи сборной, тимофеевки, лисохвоста, овсяницы, ржи, мятлика, пырея.

Коэффициент К превышал для всех указанных аллергенов величину 1,7. Аллергены из пыльцы тимофеевки вызвал практически полное тушение флуоресценции клеток К 69. Таким образом предложенный способ позволяет:

ускорить поределение чувствительности к аллергену по сравнению с прототипом не менее, чем в 5 раз:

повысить точность определения до 100%; упростить процедуру определения; уменьшить объем необходимой для определения крови с 40 мл до 0,2 мл.

Формула изобретения

Способ определения чувствительности организма к пыльцевым аллергенам путем инкубации пассивно сенсибилизированных лимфоцитов тимуса крысы с аллергеном и

флуоресцентным красителем 4(п-диметила- миностирил)-1-метилпиридиний с последующим учетом результатов реакции с помощью люминесцентного микроскопа, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения точности, ускорение и упрощение способа, лимфоциты тимуса сенсибилизируют плазмой крови исследуемого пациента, флуоресцентный краситель используют в концентрации

0,2-0,7 мкМ и при снижении количества флуоресцирующих клеток в поле зрения микроскопа в 1,5 и более раз по сравнению с реакционной смесью без аллергена определяют повышенную чувствительность к данному аллергену.

Изобретение относится к медицине, в -частности к аллергологии, Цель изобретения - повышение точности, ускорение и упрощение способа. Изобретение заключается в том, что в суспензию лимфоцитов тимуса крысы вводят последовательно плазму крови исследуемого больного, водный раствор аллергена и водный раствор флуоресцентного красителя 4-{п-диметиламиностирил)- 1-метилпиридиния. Лимфоциты инкубируют с введением ингредиентами, после чего исследуют в люминесцентном микроскопе. Подсчитывают количество флуоресцирующих клеток на каждые 100 клеток в суспензии и при его снижении более чем в 1,5 раза (на 30-70%) по сравнению с контролем/контроль проба без аллергена/ определяют повышенную чувствительность к аллергену. Предлагаемый способ позволяет ускорить определение не менее чем в 5 раз, повысить точность в 1,5 раза, а также упростить процедур, определения. V fe