Способ диагностики аллергии Советский патент 1985 года по МПК A61B10/00 

о

О) |41

1

Способ относится к медицине и может быть применен при диагностике и лечении бронхиальной астмы.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Обычным образом берут у больного 2-3 мл венозной крови. Забор производят в присутствии 40 ед/мл гепарина. Разводят кровь в 3 раза фосфатным буфером и в градиенте плотности фиккола-вер.ографина вьщеляют суспензию чистых лимфоцитов. Доводя концентрацию клеток в суспензии до 5-10 мл (среда 199 является средой для хранения исследования клеток), В лунки стандартного иммунологическогЬ плато разливают по 0,05 MJI суспензии лимфоцитов. Добавляют туда 5 мкл исследуемых аллергенов . В одну лунку - контрольную, вносят 5 мкл физиологического раствора. Помещают плато в термостат и инкубируют при 37 С в течение 60 мин. Затем содержимое лунок пас.теровской пипеткой переносят в центрифужные пробирки, добавляют в каждую пробирку по 5 мл среды 199 и центрифугируют при ISOgxlO мин. Таким образом .отмывают избыток аллергена, не связавшегося с .лимфоцитами. Осадок, который содержит клетки, связавщие аллерген, ресуспендируют в 0,05 мл бесцветной среды Хенкса. Добавляют в каждую пробирку по 0,01 мл раствора клортетрациклипа в модифицированной среде Хенкса, содержащей 0,6 мМ CaCli.

97640 2

Концентрация раствора зонда 5 х х10 моль/л. В такой концентрации хлортетрациклин не обладает цитотоксическим действием на лимфоциты. Через 5-10 мин каплю окрашенной суспензии лимфоцитов Наносят на предметное стекло,.накрьгаают покровным стеклом и исследуют в люминесцентном микроскопе. Длина волны возбуждшощего света 360 нм, света флуоресценции 540 нм. В образовавшемся препарате живых окрашенных лимфоцитов часть клеток ярко флуоресцирует зеленым светом, часть остается неокрашенной. Подсчитывают число флуоресцирующих лимфоцитов на каждые 100 клеток в суспензии.

При обследовании предлагаемым способом контрольной группы здоровьпс добровольцев (7 человек) оказалось, что количество флуоресцирующих лимфоцитов без инкубации их с аллергенами колеблется от 2 до 12%. Предварительная инкубация- клеток с ал аллергенами домашней пыли и растительного происхождения не приводила к достоверному изменению числа светящихся лимфоцитов. У больных с |бронхиальной астмой (атоническая форма) наблюдалась выраженная динамика, которая заключалась в увеличении качества флуоресцирующих лимфоцитов после инкубации их специфическим аллергеном,

В табл. 1 приведены результаты обследования больных бронхиальной астмой предлагаемым способ и ранее известными методами постановки кожньтх и ингаляционных проб.

Таблица 1

СПОСОБ ДИАПЮСТИКИ АЛЛЕРГИИ путем инкубации лимфоцитов крови. пациентов в присутствии специфического аллергена с последующим подсчетом стимулированных клеток, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, аллерген используют в концентрации 0,01-0,05 мкг/мл, а лимфоциты обрабатывают 0,0005-0,0б1%-ным раствором хлортетрациклина до и после инкубации и при, увеличении количества флуоресцирующих клеток на 828% диагностируют специфическую аллергию.

цательный

Из табл. 1 видно, что .совпадение результатов ингаляционнога и кожног тестов наблюдаются лишь в 60% случаев (6 из 10). Использование предлагаемого способа показывает, что увеличение количества флуоресцирующих клеток после инкубации с соответствующим аллергеном на 8 и более процентов в 90% случаев (9 из 10) совпадает с положительной реакцией ингаляционной пробы. Незначительные изменения числа светящихся клеток (в сторону увеличения или уменьше,ния) соответствуют отрицательному результату в ингаляционном тесте. В случае одновременной постановки каждой пробы и предлагаемого способа увеличение количества свеТаким образом, инкубация лимфоцитов с аллергеном, к которому они сенсибилизированы, приводит в 100%

тящихся клеток на 8% и более соответствует положительной реакции в II случаях из 17 (64%). Здесь

расхождение возникает, возможно, из-за ложно положительных кожных проб. Незначительные изменения в числе флуоресцирующих лимфоцитов в 100% случаев совпадает с отрицательной кожной пробой.

В табл. 2 приведены результаты использования предлагаемого способй у больных риносинусопатией, лекарственной аллергией, дерматитами. Видно, что инкубация лимфоцитов со специфическим аллергеном приводит к увеличению количества флуоресцирующих клеток более чем на 8%..

Таблица 2

случаев к изменению количества светящихся клеток в суспензии на 8 и более процентов. Инкубация лимфо71197640 8

;цитов с неспецифическими аллергена-доноров не реагируют на инкубацию

ми не приводит к столь значительнымсо всеми исследованными аллергенаизменениям числа флуоресцирующихми изменением количества фпуоресклеток. Лимфоциты крови здоровых:цирующих клеток.