Способ диагностики аллергии Советский патент 1991 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии.

Цель изобретения - повышение точности и ускорения способа,

Способ осуществляют следующим образом.

У больного берут кровь из пальца или из вены в гепаринизированную пробирку (количество крови зависит от того, на какое количество аллергенов необходимо определить реакцию - для определения реакции нк 1 аллерген достаточно 0,5 мл крови). Пробирку с кровью оставляют при комнатной температуре на 45 мин под углом 45° и еще на 45 мин в вертикальном положении для расслоения крови на плазму с лейкоцитами и осадок эритроцитов. После отстаивания плазму с лейкоцитами собирают в отдельную пробирку и наслаивают ее на градиент плотности фиколл-верографин 1,077, центрифугируют пробирку 30 мин при 300 g при комнатной температуре. После центрифуги- рования на градиенте плотности образуется кольцо лимфоцитов, его снимают и используют для других целей, а осадок, содержащий гранулоциты с небольшой примесью эритроцитов, трижды промывают раствором Хенксэ (т.е. центрифугируют 15 мин при 300 g) и ресуспендируют гранулоциты в растворе Хенкса до концентрации 2 10//мл. Клетки разносят по 0,15 мл в 2 пробирки - контрольную и опытную. В контрольную пробирку добавляют 0,05 мл раствора Хенкса, а в опытную 0,05 мл аллергена, растворенного на растворе Хенкса до концентрации 2000 PNU/мл (конечная концентрация аллергена в суспензии гра- нулоцитоа таким образом составляет 500 PNU/мл. Через 30 с после внесения раствора Хенкса и аллергена в опытную и контО

о

NJ

СЛ

«™&

рольную группу пробирки добавляют по 2 мкл раствора квина-2 в концентрации 500 мМ, а конечная концентрация краски в растворе составляет 5 мМ. Контрольную и опытную пробирки инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 мин, По окончании срока инкубации измеряют интенсивность флуоресценции не менее 10000 клеток в контрольной и опытной пробирках с помощью Проточного цитофлуориметра и возбуждение люминесценции проводят лучами с Я 340 нм, регистрируя люминесценцию в области спектра 490 нм. Получают гистограммы, где по оси ординат обозначено количество клеток, а по оси абсцисс - инт ен- сивность свечения. Полученные гистограммы обрабатывают с помощью стандартной измерительной программы YI/Y2 фирмы Konton Blldapalyse или любой аналогичной программе. С помощью этой программы на каждой гистограмме определяют координаты средней точки. Сравнивают координаты средней точки контрольной и опытной гистограмм и при смещении средней точки гистограммы опытной пробы вправо по оси абсцисс по сравнению с контрольной на 10% и более диагностируют аллергию к данному аллергену.

Пример 1. Миша А., 8 мес., поступил в больницу с диагнозом Распространенная экзема. Болен с 4 мес., когда после введения прикормов (каши нэ коровьем молоке и овощные пюре) появились экзематозные проявления на щеках и на лбу, распространившиеся впоследствии по всему телу. Кожные и провокационные пробы с пищевыми аллергенами ке проводились из-за тяжелого состояния ребенка и обширности кожных поражений.

С помощью предлагаемого способа исследованы реакции гранулоцитов больного на аллергены коровьего молока, пшеницы, картофеля, капусты, моркови, белка куриного яйца, трески, хека, Получено смещение средних точек гистограмм вправо по оси абсцисс с аллергеном коровьего молоха на 10%, аллергена пшеницы на 16%, аллергена моркови на 19%. С остальными аллергенами пробы были отрицательными (смещение средней точки гистограммы на 0 - 9%). По результатам лабораторных проб с помощью предлагаемого способа диагностирована аллергия к коровьему молоку, манной каше (пшеница), моркови. Исключение этих продуктов из ди- егы ребенка уже через 3 недели привело к очищению кожных покровов и улучшению общего состояния ребенка. Провокационные пробы с коровьим молоком, манной кашей и морковным соком были резкоположительными, что проявлялось з обострении экземы и ухудшении общего состояния ребенка. Это подтвердило правильность диагностики с помощью предлагаемого способа.

Пример 2. Таня О., 12 лет, поступила

в больницу с жалобами на зуд век, слезотечение, светобоязньг насморк, проявляющиеся в весеннее время года. Впервые эти симптомы отмечены в возрасте 9 лет весной

во время прогулки в парке. Заподозрена пальцевая сенсибилизация, но провести кожные и провокационные пробы не представлялось возможным, так как больная поступила в период обострения заболевания и

в весеннее время года, когда пробы с пыльцевыми аллергенами не проводятся. С помощью метода, изложенного в известном способе, исследованы реакции лимфоцитов периферической крови с аллергенами березы, ольхи, лещины. Получена слабополо- жительнэя реакция с аллергеном ольхи, с остальными аллергенами пробы были отрицательными. С помощью предлагаемого способа изучены реакции гранулоцитов

больной на аллергены березы, ольхи, лещины, тимофеевки, овсянницы, райграса, лисохвоста, полыни, лебеды, амброзии. Получено смещение средних точек гистограмм проб с аллергеном ольхи (на 34%),

пыльцы березы (на 52%) и лещины (на 29%). Больная девочка повторно поступила в больницу зимой следующего года, были проведены кожные пробы с пыльцевыми аллергенами, которые были резкоположительными с аллергенами пыльцы березы, ольхи и лещины, что подтверждает правильность диагностики.

Изобретение позволяет обеспечить вы- сокую точность диап.остики аллергии (на 50% выше по сравнению с прототипом), что в 15 раз уменьшает количество необходимой для реакции крови, в 6 раз количество аллергена, в 2 раза продолжительность ре- акции.

Формула изобретения

Способ диагностики аллергии путем ин- кубации лейкоцитов периферической крови с аллергеном и измерения содержания кальция в клетках по интенсивности свечения в них флуоресцентного кальциевого красителя, отличаю щ ийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, из крови выделяют граиулоциты, в качестве красителя используют квин-2 п концентрации 500 мМ, а измерение интенсивности свечения ведут на проточном цитофлуори- метре по гистограмме и при смещении сред

ней точки гистограммы опытной пробы в нию с контрольной, содержащей раствори- сторону увеличения на 10% и более по оси тель. диагностируют аллергию кданномуал- интенсивности флуоресценции по сравне- лергену.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для выявления причинно-значимых аллергенов у больных с аллергическими заболеваниями. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа. Для осуществления способа по 0,15 мл гранулоцитов периферической крови в концентрации 2 -10 /мл вносят в опытную и контрольную пробирки. В опытную пробирку вносят аллерген, в контрольную - раствор Хенкса. Через 30 с обе пробы окрашивают флуоресцентным кальциевым красителем квином-2, а затем измеряют интенсивность флуоресценции клеток в контрольной и опытной пробах с помощью проточного цитофлуотиметра. Сравнивают координаты средней точки гистограмм, полученных в контрольной и опытной пробах, и при смещении средней точки гистограммы опытной пробы вправо по оси абсцисс по сравнению с контрольной на 10% и более диагностируют аллергию к данному аллергену. сл с