Штамм актиномицетов SтRертомYсеS RоснеI, осуществляющий полное разложение 2,4,6-трихлорфенола, или 2,4-дихлорфенола, или 2,6-дихлорфенола, или 2-хлорфенола Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12S13/00 

Ј

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод и почвы от хлорированных фенолов Цель изобретения - получение нового штамма, обладающего способностью к разложению повышенных концентраций широкого спектра хлорированных фенолов Штамм Streptomyces rochel BKM Ac-1284D получен при выделении из смешанного образца почв хлопковых полей. Штамм полностью разлагает 2,4,6-трихлорфенол при концентрации его до 400 мг/л, а также 2,4- дихлорфенол, 2,6-дихлорфенол, 2-хлофенол при концентрации их в среде до 50 мг/л как в ростовых условиях, так и покоящимися отмытыми клетками.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод и почвы от хлорированных фенолов.

Цель изобретения - получение нового штамма, обладающего способностью к разложению повышенных концентраций широкого спектра хлорированных фенолов

Изобретение заключается о выделении штамма актиномицетов Streptomyces rochei BKM Ac-1284D, деградирующего 2-хлор- или 2,4-или 2,6-дихлор, или 2,4,6-трихлорфенол. Штамм полностью разлагает 2-хлорфенол, 2,4-, 2,6-дихлорфенолы в концентрации 50 мг/л; 2,4,6-трихлорфенол (2,4,6-ТХФ) в концентрации 10-400 мг/л, используя их в качестве единственного источника углерода. В процессе утилизации хлорфенолов в среду выделяется стехиометрическое количество хлор-ионов.

Штамм Streptomyces rochei 303 выделен методом накопительной культуры из смешанного образца почв хлопковых полей Узбекской ССР, в течение 15-20 лет обрабатываемых высокими дозами хлорароматиче- ских пестицидов, депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под № Ас-12840.

Для получения чистой культуры суспензию спор высевают на селективную среду, отдельно стоящую колонию переносят на полноценную агаризованную среду, покрытую мембранным фильтром (Milllpore. USA) с размером пор 0,12 мкм. Проросший через фильтр воздушный мицелий пересевают на селективную агаризованную среду и исО

ел ю

CJ

со ел

пользуют в качестве посевного материала в экспериментах.

Характеристика штамма.

Морфологические и культуральные признаки.

Спороносцы спиральные, поверхность спор гладкая. В клеточной стенке присутствует LL-диаминопимелиновая кислота. Дифференцирующие сахара не содержатся. Гифы длинные, хорошо ветвящиеся. Споры округлые, 1-1,5 мкм в диаметре. Грамполо- жителен. некислотоустойчив.

На овсяном и минеральном агаре воздушный мицелий серый, субстратный бесцветный, иногда бледно-розовый, растворимый пигмент не образуется. На органическом агаре воздушный мицелий белый или серо-белый, субстратный мицелий бесцветный или слабо-желтый, растворимый пигмент отсутствует. На органическом агаре с тирозином меланоидный пигмент не образуется. Диаметр колоний 2-8 мм. Имеет запах геосмина. Субстратный мицелий, как правило, не фрагментируется.

Физиологические признаки.

Как источник углерода использует цел- лобиозу. фруктозу, инозит, сахарозу, галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, L-рамнозу, ксилозу, инулин. Не утилизирует раффинозу, адонит, эритрит, D-арабинозу. Как источ- ник азота использует L-гистидин, гидроксипролин, слабо а-аминомасляную кислоту.

Гидролизует пектин, лизитин, арбутин.

Образует H2S, обладает нитратредук- тазной активностью. Растет на средах с 7% NaCI: 0,01% NaNa: 0.1% фенола при 45°С. Устойчив к неомицину в концентрации 50 мкг/мл. Чувствителен к рифампицину в концентрации 50 мкг/мл.

Не обладает антибиотической активностью в отношении Asperglllus nlger, Bacillus sobtllls, Streptomyces murlnus.

Растет в диапазоне температур 10- 37°С, оптимум - 27°С.Аэроб.

Штамм не патогенен.

Условия хранения: в лиофилизирооан- ном виде - в ампулах при 4°С и под жидким азотом - при 95-9б°С. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 14 дней) на минеральной среде состава, г/л: NasSCM 0,1; MgS04 7H20 0.8: КН2РО 0,7; (МНд)2НР041.5; 2,4,6-трихлорфенол 0,2: агар 15,0 (2.4,6-трихлорфенол добавляют в виде фенолята натрия).

П р и м е р 1. Streptomyces rochel BKM Bc-1284D выращивают в течение 5 сут на косяках с минеральной агаризованной средой состава, г/л: NaSOo 0,1; MgS04 7H O

0,8; КН2Р04 0,7; ( 1,5; 2,4.6-ТХФ (в виде натриевой соли) 0,05; агар 15,0. Выросшую культуру вносят в жидкую среду аналогичного состава, разлитую по 100 мл в

медицинские колбы объемом 700 мл, 2,4,6- ТХФ вносят в концентрации 10 мг/л, культивируют при 29°С в темноте на качалке при 180-200 об/мин.

2,4,6-ТХФ и продукты его метаболизма

экстрагируют из подкисленной до рН 2,0 культуральной жидкости эфиром. Качественный анализ осуществляют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках Sllufol UV-254, Пластины проявляют в

системе растворителей бензол:диоксан:ук- сусная кислота 90:10:2. Обнаружение производят в УФ-свете и опрыскиванием реагентом на хлорсодержащие вещества (0,1 г AgNOa, растворяют в смеси 1 мл дистиллированной воды, 190 мл ацетона и 10мл 2-феноксиэтанола, к раствору добавляют 1 каплю 30%-ной Н202). После экспонирования в течение 15 мин в длинноволновом ультрафиолетовом свете хлорсодержащие

вещества проявляются в виде серых пятен на белом фоне. Соединения, имеющие фе- нольный гидроксил, обнаруживаются после опрыскивания диазотированным бензиди- ном в виде желто-коричневых пятен. Продукты метаболизма анализируют с помощью хромато-масс-спектрометрии на приборе LKB-2091 и в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия анализа в системе ВЭЖХ:

колонка LKB-2134 размером 4 х 250 мм, заполненная Spherisorb ODS-2 частицы 5 р т, растворитель - 70% метанола, 30% воды, скорость потока 0,7 мл/мин, УФ-детек- тор с переменной длиной волны LKB-2151.

Измерения проводят при длине волны 280 и 311 нм.

Количественное определение 2,4,6- ТХФ проводят спектрофотометрически по поглощению в ультрафиолетовом свете при

Я 311 нм на приборе Specord M-40 (Karl- Zeiss, lena, DDR), газохроматографически на хромографе модели 304 фирмы Руе Unlearn (Phillips) на колонке длиной 1,5 м, внутренним диаметром 2 мм с 7% ПЭГА и 3% Н3Р04 на Chromosorb W/AW 30/100

меш, температура ввода и колонки 150°С, детектора 160°С, газ-носитель азот, 30 мл/мин.

Концентрацию хлор-ионов в культуральной жидкости измеряют после отделения клеток центрифугированием. Анализ проводят с помощью хлор-селективного электрода Orion 94-17 на ионоанализаторе Ion Analyzer EA940 (Orion). Калибровку электрода осуществляют по стандартам, приготовленным на среде для культивирования.

Культура способна к утилизации 2,4,6- ТХФ в концентрации 10 мг/л. Время полного разложения 1 сут. В культуральной жидкости при этом обнаруживается стехио- метрическое количество хлор-ионов.

П р и м е р 2. Процесс проводят аналогично примеру 1, но в среду для культивирования вносят 100 мг/л 2,4,6-ТХФ в виде натриевой соли. При этой концентрации 2,4,6-ТХФ исчезает полностью за 6 сут. в культуральной жидкости определяется при этом стехиометрическое количество хлор- ионов, оптическая плотность клеточной суспензии возрастает примерно в 5 раз от 0,012 до 0,067.

Примерз. Процесс проводят аналогично примеру 1, но в среду для культивирования вносят 400 мг/л 2,4,6-ТХФ в виде натриевой соли. 2.4,6-ТХФ исчезает за 10 сут, в культуральной жидкости обнаруживается стехиометрическое количество хлор- ионов.

П р и м е р 4. После выращивания исходного штамма на косяках с селективной ере- дои (аналогично примеру 1) культуру вносят в жидкую среду состава, г/л: бактопептон 5,0; дрожжевой экстракт 3,0; глюкоза 5,0; К2НР04 0,2, разлитую по 100 мл в медицинские колбы объемом 700 мл, и выращивают в течение 20 ч при 28-30°С при перемешивании. Затем клетки отделяют центрифугированием и трижды отмывают 0.05 М фосфатным буфером, рН 7,0. Клетки вносят в количестве 40 мг/мл по сырому весу в колбы со 100 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7.0. 2-Хлорфенол.добавляют в виде водного раствора натриевой соли до конечной концентрации 50 мг/л. Инкубируют при 29°С в темноте на качалке при 180-200 об/мин. Через 0, 6, 15, 18, 21, 24 ч отбирают пробы для анализа. Количественное определение хлорфенолов, минерального хлора и идентификацию метаболитов проводят методами, описанными в примере 1.

Покоящиеся клетки Streptomyces rochei способны разлагать в течение суток 2-хлор- фенол в концентрации 50 мг/л. При этом наблюдается выделение стехиометрическо- го количества хлор-ионов, в качестве мета- болита обнаруживается хлоргидрохинон.

П р и м е р 5. Процесс проводят аналогично примеру 4, но в среду для инкубации

вносят 2.4-дихлорфенол в виде натриевой соли до конечной концентрации 50 мг/л. Покоящиеся клетки штамма разлагают 2,4- ДХФ в течение 1 сут с выделением стехио- метрического количества хлор-ионов, в качестве метаболита обнаруживается хлор- гидрохинон.

П р и м е р 6. Процесс проводят аналогично примеру 4, но в среду для инкубирования вносят 2,6-дихлорфенол в виде натриевой соли для конечной концентрации 50 мг/л.

Покоящиеся клетки штамма разлагают 2,6-ДХФ в течение 1 сут с выделением сте- хиометрического количества хлор-ионов, в качестве метаболитов обнаруживается дихлоргидрохинон,хлоргидрохинон и хлор- содержащий продукт расщепления ароматического кольца с массой 133.

Пример. Процесс проводят аналогично примеру 4, но в среду для инкубирования вносят 2,4,6-дихлорфенол в виде натриевой соли до конечной концентрации 50 мг/л.

Покоящиеся клетки штамма разлагают 2,4,6-трихлорфенол в течение суток с выделением стехиометрического количества хлор-ионов, в качестве метаболитов обнаруживается дихлоргидрохинон,хлоргидрохинон и хлорсодержащий продукт расщепления ароматического кольца с массой 133.

Таким образом, штамм Streptomyces rochei полностью разлагает 2-хлор-, 2,4-дих- лор-. 2,6-дихлор-, 2,4,6-трихлофенолы. Разложение всех четырех изомеров сопровождается стехиометрическим выделением хлор-иона. Штамм усваивает более широкий спектр хлорфенолов, разлагает их как в ростовых условиях, так и покоящимися отмытыми клетками, что имеет большое значение, так как штамм может использоваться не только для очистки промстоков, где возможна технология с иммобилизованными неразмножающимися клетками, но и для очистки мест локального загрязнения, где потребуется, чтобы штамм рос на этих субстратах.

Формула изобретения

Штамм актиномицетов Steptomyces rochei BKM Ac-1284D, осуществляющий полное разложение 2,4,6-трих- лорфенола или 2,4-дихлорфенола, или 2,6-дихлорфенола, или 2-хлорфено- ла.