Штамм бактерий ВRеVIвастеRIUм Sp., осуществляющий полное разложение 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной или 2-метил-4-хлорфеноксиуксусной, или 2,4-дихлорфеноксиуксусной, или 2-хлорбензойной, или 4-хлорбензойной кислоты Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12S13/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для микробиологической деградации хлорированных феноксиуксусных и бензойных кислот при очистке сточных вод и локально загрязненных участков почвы.

Цель изобретения состоит в получении штамма, обладающего стабильной способностью к разложению расширенного спектра хлорароматических соединений.

Поставленная цель достигается выделением штамма бактерий В rev (bacterium

sp. BKM B-1731D, разлагающего 2,4,5- трихлорфеноксиуксусную (2,4,5-Т), 2,4-дихлорфеноксиуксусную, или 2- метил-4-хлорфеноксиуксусную, или 2- хлорбензойную, или 4-хлорбензойную кислоты. Штамм полностью разлагает перечисленные соединения, используя их в качестве единственного источника углерода и энергии, с выделением стехиометрического количества минерального хлора вереду.

Штамм выделен методом накопительных культур из смешанного образца почв хлопковых полей Узбекской ССР, в течение

с со

00

ел

Ч)

15-20 лет обрабатываемых высокими дозами хлорароматических соединений,

Чистая культура получена путем 15-ти кратного пересева одиночной колонии на минеральной агаризованной среде с 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода.

Характеристика штамма.

Морфологические и культуральные признаки.

Штамм имеет цикл развития кокк-палочка-кокк. Культура в стационарной фазе роста состоит из кокков и. коротких палочек с закругленными концами, которые после перенесения в свежую среду растут, образуя неправильные палочки длиной 5,0-6,0 мкм и шириной 0,5-0,6 мкм, характерные для культуры в экспоненциальной фазе роста. Некоторые палочки изогнуты под углом. Строение клеточной стенки характерно при грамположительных бактерий (по данным электронной микроскопии). На мясопептон- ном агаре, разбавленном в 10 раз, колонии слабожелтые с прозрачным краем и плотной серединой, края ровные, плоские, центр колонии выпуклый. На мясопептон- ном бульоне, разбавленном в 10 раз, рост в виде мути, пигментов в среду не выделяет. На минеральной среде с цитратом колонии белые, плоские, с ровным краем, пигментов в среду не выделяет. На минеральной среде с глюкозой колонии белые, с ровным краем, -плоские, шероховатые.

Физиологические признаки.

Аэроб, дает положительную каталазную и отрицательную оксидазную реакции, оптимальная температура для роста 29-30°С.

Усваивает глюкозу и слабо образует на ней кислоту, усваивает цитрат, салицилат, n-оксибензоат, протокатехоат, гентизат, го- могенизат, лизин, глицин, серии, крахмал, целлюлозу не гидролизует, желатину разжижает.

Хемотаксономические признаки.

Аминокислоты клеточной стенки соответствуют мезо-диамино-пимелиновой кислоте с аланином и глутаминовой кислотой (молярное соотношение 1:3:2). Миколовые кислоты отсутствуют. В качестве основного менахинона обнаружен насыщенный менахинон с изопреновыми единицами МХ-8(Н4).

Условия хранения.

Штамм Brevlbacterlum sp. ВКМ В- 1731D хранится в лиофилизированнрм виде в ампулах при t 4°C и под жидким азотом при t -(95-96)°C. Штамм-может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10- 14 дней) на минеральной среде состава, г/л: КН2РСМ 0,1; (МНФНР04 2,0; Na2SC 4 0,1;

MgSCM 0,3; КМОз 2,0; 2,4.5-трихлорфенокси- уксусная кислота (2,4-,5-Т) 0,3; агар 15,0. 2,4,5-Т вносят в виде натриевой соли.

П р и м е р 1. Штамм Brevibacterium sp.

ВКМ B-1731D выращивают в течение 24 ч на косяках с минеральной агаризованной средой состава, г/л: КН2РСМ 0,1; (МН4)2НРСм 2,0; Na2SCMO,1;MgS040,3; KNOs 2.0; 2,4,5-Т 0,2; агар 15,0.

0Выросшую культуру вносят в жидкую

среду аналогичного состава, разлитую по 100 мл в медицинские колбы объемом 700 мл. Перед засевом в колбу вносят 2,4,5-Т (0,01-0,2 г/л) в виде водного раствора на5 триевой соли. 2,4,5-Т или продукты ее метаболизма экстрагируют из культуральной жидкости, подкисленной до рН 2,0 эфиром. Качественный анализ осуществляют с помощью тонкослойной хроматографии на

0 пластинах Silufol UV-254, (Kavalier, ЧССР). Пластины проявляют в системе растворителей бензол:диоксан:уксусная кислота 90:10:0,2 (об/об). Обнаруживание проводят в УФ-свете и опрыскиванием реагентом на

5 хлорсодержащие углеводороды (0,1 гАдМОз растворяют в смеси 1 мл дистиллированной воды, 190 мл ацетона и 10 мл 2-феноксиэта- нола, к раствору добавляют 1 каплю 30%- ной Н202. После экспонирования в течение

0 15 мин в длинноволновом УФ-свете хлорсодержащие вещества проявляются в виде серых пятен на белом фоне, Соединения, имеющие фенольный гидроксил, обнаруживаются в виде желто-коричневых пятен по5 еле опрыскивания диазотированным бензидином.

Продукты метаболизма анализируют с помощью газовой хроматографии - масс- спектрометрии на приборе LKB-2091. Для

0 анализа кислот пробы обрабатывают диазо- метаном. Газовую хроматографию осуществляют на стеклянной колонке 180 х 0,2 мм, фаза 1,5% OV-101 (Merck) на носителе Chromosorb W-HP (100-120 меш), темпера5 тура испарителя 200°С, колонки 90-200°С, при скорости прогрева 5 град/мин, газ-носитель гелий, скорость 15 мл/мин. Условия масс-спектрометрического анализа: температура сепаратора и источника ионов 250°С,

0 энергия электронов 70 ev. Ускоряющее напряжение 3,5 mb, ток ловушки 25/л А.

Количественное определение 2,4,5-Т проводят в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), колонка

5 размером 4 х 250 мм, заполненная Spherisorb ODS-2 с размером частиц 5 мкм (LKB-2134), растворитель - 45% метанола и 55% воды, скорость .потока 0,7 мл/мин, детектор с переменной длиной волны (LKB Variable Wavelength monitor 2151). 2,4,5-Т и

продукты ее метаболизма определяют измерением поглощения при 280 нм.

Концентрацию хлор-ионов в культу- ральной жидкости измеряют после центрифугирования клеток на ионоэнализаторе Jon Analyzer EA-940 , (Orion) с помощью хлорселективного электрода (Orion) 94-17 Chloride electrode). Стандартные растворы готовят в среде для культивирования.

Культура способна к утилизации 2,4,5-Т (концентрация 10-400 мг/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. В процессе роста штамма наблюдается лаг-фаза (24 ч), после которой происходит быстрая убыль 2,4,5-Т. Содержание 2,4.5-Т при исходной концентрации 200 мг/л через 24 ч, по данным HPLC составляет 96% от исходного, через 48 ч - 35% и через 60 ч 2,4,5-Т в среде не обнаруживается. В куль- туральной жидкости при этом определяется стехиометрическое количество хлор-ионов. Численность клеток возрастает на 4-5 порядков с 2 106до6 10-2 1011 кл/мл. В процессе разложения 2,4,5-Т в качестве метаболитов обнаружены 2,4,5-трихлорфенол, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, 4- хлорфеноксиуксусная кислота, дихлорока- техол.

Таким образом, полное разложение 2,4,5-Т культурой BKM-173D при концентрации 200 мг/л происходит за 60 ч.

П р и м е р 2. Определение стабильности штамма.

Штамм Brevibacterium sp. BKM-1731D в экспоненциальной фазе роста высевают на полноценную питательную среду (МПА, разбавленный 10 раз). Через 48 ч отдельно стоящую произвольно выбранную колонию пересевают 3 раза каждые 24 ч на аналогичную полноценную среду. При среднем времени генерации 50 мин это составляет 86 генераций. Затем снова рассеивают до отдельных колоний на полноценной среде и проверяют способность 30 колоний к росту на агаризованной среде с 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и 6 колоний - к разложению 2,4,5-Т в жидкой среде, 100% колоний после 36-130 генераций сохраняют способность к деградации 2,4,5-Т.

Полезное свойство (споссбность к разложению 2,4,5-Т) сохраняется у штамма BKM-1731D в течение 5 мес хранения на агаризованной и в жидкой среде.

П р и м е р 3. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в среду для инкубации вносят 2-метил-4-хлорфеноксиуксусную кислоту в виде натриевой соли до конечной концентрации 20 мг/л.

Штамм Brevibacterium sp. BKM-1731D в течение 5 сут разлагает ксенобиотик с выделением стехиометрического количества хлор-ионов.

П р и м е р 4, Процесс проводят аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в среду для инкубации вносят 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в виде натриевой соли до конечной концентрации 200 мг/л.

Штамм разлагает гербицид полностью в течение 2 сут с выделением стехиометрического количества хлор-ионов. П р и м е р 5. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в среду для инкубации вносят 2-хлорбензойную кислоту в виде натриевой соли до конечной концентрации 20 мг/л. Штамм разлагает 2ХБ полностью в течение 7 сут с выделением стехиометрического количества хлор-ионов.

П р и м е р 6. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1 зэ исключе- нием того, что в среду для инкубации вносят 4-хлорбензойную кислоту в виде натриевой соли до конечной концентрации 20 мг/л.

Штамм полностью разлагает 4ХБ в течение 5 сут с выделением стехиометрического количества хлор-ионов.

Таким образом, выделен активный штамм Brevibacterium sp. BKM-1731D, который разлагает широкий спектр галогениро- ванных соединений. Кроме 2,4,5-Т, он разлагает 2,4-дихлорфеноксиуксусную, 2- метил-4-хлорфеноксиуксусную кислоты, а также хлорбензойные кислоты - 2-хлорбензойную и 4-хлорбензойную.

Деградирующая способность штамма стабильно сохраняется после многократных пересевов на полноценной среде. Формула изобретения Штамм бактерий Brevibacterium sp. ВКМ B-1731D, осуществляющий полное раз- ложение 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной, или 2-метил-4-хлорфеноксиуксусной, или 2,4-дихлорфеноксиуксусной, или 2-хлорбен- зойной, или 4-хлорбензойной кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для микробиологической деградации хлорированных феноксиуксусных и бензойных кислот при очистке сточных вод и локально загрязненных участков. Цель изобретения - получение штамма, обладающего стабильной способностью к разложению расширенного спектра хлорароматических соединений. Штамм бактерий Brevibacterium sp. ВКМ В- 1731D получен при выделении из смешанного образца почв хлопковых полей. Штамм способен к полной утилизации в течение 60 ч 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной и в течение 48 ч 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислот в качестве единственного источника углерода и энергии при концентрации их до 200 мг/л, сохраняя эту способность в течение 130 генераций. Штамм также полностью разлагает за 5-7 сут 2-метил-4-хлор- феноксиуксусную, 2-хлорбензойную и 4-хлорбензойную кислоты в концентрации 20 мг/л. (Л С