СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ FAE1.1, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СОДЕРЖАНИЕ ЭРУКОВОЙ КИСЛОТЫ В МАСЛЕ СЕМЯН РАПСА, С ПОМОЩЬЮ dCAPS-МАРКЕРОВ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области селекции растений, а именно маркерсопутствующему отбору. Создание на основании генетических карт специфических молекулярно-генетических маркеров к отдельным хозяйственно-ценным генам дает возможность проводить маркерный отбор (MAS - Marker Assisted Selection). Маркерный, или маркерсопутствующий отбор - сравнительно новый подход в селекции растений. Его применение позволяет избежать трудоемкой или дорогостоящей оценки агрономически ценного признака, по которому ведется селекция.

В частности, изобретение относится к главному методологическому подходу в подобного рода исследованиях - применению молекулярных маркеров для идентификации желательных признаков в селекционном материале.

Изобретение может использоваться для геном-специфической идентификации генов FAE1.1, отвечающих за синтез эруковой кислоты у рапса. Использование подобного подхода позволяет независимо проанализировать аллели, локализованные в А геноме рапса, и установить их гомо- либо гетерозиготное состояние, сокращая таким образом количество поколений и, соответственно, количество лет, необходимое для выравнивания данного признака в селекционном материале.

Для селекции рапса одной из существенных проблем является аллополиплоидный характер генома. В формировании селекционно ценного признака участвуют оба родительских генома, причем аллели, определяющие признак, могут быть практически идентичны. В этой связи возможным решением проблемы выявления доли участия определенного генома в развитии селекционно цепного признака может быть разработка геном-специфических ДНК-маркеров.

Уровень содержания эруковой кислоты у рапса определяется двумя аллелями, локализованными в А- и С-геномах [1,2]. Функция гена FAE1 в синтезе эруковой кислоты у рапса была доказана путем генетической трансформации низкоэруковых сортов [3]. Были охарактеризованы оба гомолога гена FAE1 (Bn-FAE1.1 и Bn-FAE1.2). Они проявляют сходство нуклеотидов на 99,4%. Выявлено, что к формированию растений рапса типа «канола» с практически нулевым содержапием эруковой кислоты приводит замена одной пары оснований гена FAE1.1 генома А, результатом которой является замена аминокислоты серии на фенилаланин [4].

Аналогами патентуемого способа являются методы, основанные на биохимическом определении жирнокислотного состава масла в семенах рапса. Подобные традиционные методы оценки признаков осуществимы только на определенной стадии развития растения - после обмолота семян. При наличии в гетерозиготном состоянии нежелательных генов, определяющих синтез эруковой кислоты, распространение этих генов происходит при опылении и фенотипически проявляется в следующем поколении.

Прототипом по отношению к заявляемому способу являются специфические ДНК-маркеры к генам FAE1.1, основанные на детекции однонуклеотидной замены в геноме А рапса. Суть такого подхода заключается в определении однонуклеотидной замены с помощью метода SNaPshot[5].

Недостатком подобного анализа являются:

1) Высокая себестоимость, а также необходимость использования специализированного дорогостоящего оборудования (анализ возможен только на генетических анализаторах Applied Biosystems с помощью набора ABI SNaPshot kit).

2) Возможность появления рекомбинаций между аллелями А и С геномов рапса, что приводит к появлению SNP замены в 282 положении в С геноме и возникновению делеции в геноме А рапса [6,7]. В связи с этим использование прямой детекции мутаций без учета геном-специфичности может привести к некорректному анализу селекционного материала.

Задачей предлагаемого изобретения являлось создание способа геном-специфической и аллель-специфической идентификации гена FAE1.1, контролирующего синтез эруковой кислоты в рапсовом масле. Сохраняя достоинства метода-прототипа, как-то прямую детекцию однонуклеотидной замены в геноме и определение гомо- и гетерозиготного состояния локуса, предлагаемый способ лишен его недостатков и позволяет избежать использования специализированного оборудования и реактивов, и ниже прототипа по себестоимости.

Поставленная задача решается путем разработки системы двухступенчатой геном-специфичной идентификации аллелей гена FAE1.1, отвечающего за синтез эруковой кислоты в геноме А рапса. Данные маркеры позволяют достоверно различать гены FAE1, принадлежащие С-геному рапса, полученному от капусты, от генов FAE1, принадлежащих А-геному рапса, источником которого является сурепица.

На первом этапе для специфической амплификации фрагмента генома А рапса, содержащего ген FAE1.1, используется 50-100 нг тотальной ДНК рапса. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 200 мкМ каждого dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 1,5 мМ

MgCl₂, 1,5 единицы Taq-полимеразы в инкубационном буфере и по 0,25 мкМ праймеров следующего нуклеотидного состава:

ЕrА F 5'-CTCATTCCCGAGAAACACTGA-3'

ЕrА R 5'-CTACGATCTCCAGGCTTGTT-3'

Условия проведения реакции: денатурация - 4 мин при 94°С; циклы 2 - 35: 30 сек при 94°С, 30 сек при 55°С и 2 мин при 72°С; цикл 36-10 мин при 72°С.

Продукты реакции разделяются электрофорезом в 2% агарозном геле с добавлением этидиум бромида.

В результате амплификации разработанных для предлагаемого способа праймеров с тотальной ДНК рапса может быть получен ПЦР-фрагмент размером 980 пар нуклеотидов, который используется для последующей идентификации аллелей гена FAE1.1.

Геном-специфичность данных праймеров доказывается их избирательной амплификацией с ДНК капусты огородной и сурепицы. Как показано на фигуре 1, маркер к А-геному размером 980 пар нуклеотидов амплифицируется с ДНК рапса и сурепицы (2 и 3 дорожки), с ДНК капусты амплификация отсутствует (1 дорожка).

Полученный ПЦР-фрагмент используется в качестве ДНК-матрицы для последующей ген-специфичной амплификации. Для этого 2 мкл ПЦР-смеси, полученной в результате 1 этапа и содержащей 50-100 нг ПЦР-фрагмента генома А, добавляется в реакционную смесь, включающую 200 мкМ каждого dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 1,5 мМ MgCl₂, 1,5 единицы Taq-полимеразы в инкубационном буфере и по 0,25 мкМ праймеров следующего нуклеотидного состава:

SATF 5'-GCTCTTGTGGTGAGCACAGAGAACA-3'

SATR 5'-TCTACGATCTCCAGGCTTGTCG-3'

Условия проведения реакции: денатурация - 4 мин при 94°С; циклы 2 - 35: 30 сек при 94°С, 30 сек при 56°С и 30 сек при 72°С; цикл 36-10 мин при 72°С.

В результате амплификации разработанных для предлагаемого способа праймеров с ПЦР-фрагментом А генома рапса, амплифицированного на предыдущем этапе, могут быть получены ПЦР-фрагменты размером 135 пар нуклеотидов, содержащие однонуклеотидную замену в случае наличия мутантной аллели на расстоянии в 2 нуклеотида от 3'-конца SATR праймера.

Праймер SATR разработан таким образом, чтобы при наличии SNP-замены возникал искусственный сайт рестрикции для рестриктазы TaqI. Полученный ПЦР-фрагмент размером 135 нуклеотидов подвергается рестрикции при 65°С в течение 3 часов. Условия проведения реакции: 1X буфер TaqI:10 mM Tris-HCl (рН 8.0), 5 mМ MgCl₂, 100 mМ NaCl и 0.1 mg/ml BSA, и 2 единицы TaqI в инкубационном буфере.

Продукты рестрикции разделяются в неденатурирующем 8%-ном полиакриламидном геле [8] и визуализируются с помощью этидиум бромида.

Как показано на фигуре 2, в результате рестрикции ампликона, полученного с помощью праймеров SAT, могут быть получены фрагменты следующего размера:

Гомозиготный ген FAE1.1 дикого типа - 135 п.н.

Гомозиготный мутантный аллель FAE1.1 - 113 п.н.

Гетерозигота по гену FAE1.1 - 135 и 113 п.н. Разработанные авторами геном-специфические ДНК-маркеры к генам FAE1, контролирующим синтез эруковой кислоты в семенах рапса, имеют ряд преимуществ:

- возможность прямой идентификации генов FAE1 в селекционном материале на ранней стадии развития растения, что позволяет в начале вегетации выбраковать нежелательный для селекционера материал и исключить проведение биохимического анализа жирнокислотного состава масла в селекционных образцах после уборки и обмолота семян. Тем самым экономятся время и средства, затрачиваемые на уход за посевами, уборку и послеуборочную обработку селекционного материала,

- независимое тестирование генов FAE1, расположенных в А и С геномах рапса, что позволяет вдвое сократить сроки создания сортов,

- низкая себестоимость анализа и возможность использования реактивов белорусского производства.

Предлагаемый способ идентификации может быть проведен на ранней стадии развития растения, что позволяет в начале вегетации выбраковать нежелательный для селекционера материал и исключить проведение биохимического анализа жирнокислотного состава масла в селекционных образцах после уборки и обмолота семян. Тем самым экономится время и средства, затрачиваемые на уход за посевами, уборку и послеуборочную обработку селекционного материала.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу идентификации генов FAE1.1, контролирующих содержание эруковой кислоты в семенах рапса. Способ включает последовательную геном-специфическую и аллель-специфическую ПЦР-реакцию. Проводят с помощью рестриктазы TaqI рестрикцию ампликона, полученного путем последовательной ПЦР с помощью прямого SATF 5'-GCTCTTGTGGTGAGCACAGAGAACA-3' и обратного SATR 5'-TCTACGATCTCCAGGCTTGTCG-3' праймеров. Получают фрагменты ДНК определенного размера. При этом гомозиготному состоянию гена FAE1.1 дикого типа соответствует фрагмент 135 п.н., гомозиготному мутантному аллелю FAE1.1 соответствует фрагмент 113 п.н., а гетерозиготе по гену FAE1.1 соответствуют фрагменты 135 и 113 п.н. Предложенное изобретение позволяет осуществлять геном-специфичную идентификацию генов FAE1.1, контролирующих содержание эруковой кислоты в масле семян рапса, на любой стадии развития растения, и позволяет исключить стадию биохимического анализа жирнокислотного состава масла. 2 ил., 1 пр.

Способ идентификации генов FAE1.1, контролирующих содержание эруковой кислоты в семенах рапса, с помощью dCAPS-маркеров, включающий последовательную геном-специфическую и аллель-специфическую ПЦР-реакцию, отличающийся тем, что с помощью рестриктазы TaqI проводится рестрикция ампликона, полученного путем последовательной ПЦР с помощью прямого (SATF 5'-GCTCTTGTGGTGAGCACAGAGAACA-3') и обратного (SATR 5'-TCTACGATCTCCAGGCTTGTCG-3') праймеров, в результате чего получают фрагменты ДНК определенного размера, соответствующие гомозиготному состоянию гена FAE1.1 дикого типа (135 п.н.), гомозиготному мутантному аллелю FAE1.1 (113 п.н.) и гетерозиготе по гену FAE1.1 (135 и 113 п.н.).