Способ выделения полисахарида из культуральной жидкости Советский патент 1991 года по МПК C12P19/04 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/12 

1

(21)4473171/13 (22) 25.06.88 (46)07.07.91. Бюл. №25

(71)Ладыжинское производственное биофармацевтическое объединение Энзим и Всесоюзный научно-исследовательский институт микробиологических средств защиты растительных и бактериальных препаратов

(72)Е.Ф.Григорьев, В.А. Болоховская , Н.Б.Мартынюк, В.Д.Иванов, В.В.Болохов- ский, В.В.Дерябин, Л.А.Старухина, Р.Н.Белова, А.А.Бузин, Т.Д.Чистова, М.Г.Козлова, А.П.Крезуб, Л.П.Вахрушев, Б,А.,Андресон и Д.М.Шахмаев

(53) 663. 18(088.8)

(56) Патент Великобритании

№ 1563392, кл. С 12 N 1/00, 1980.

Патент ФРГ №2944634, кл. С 12 Р 19/04, 1980.

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДА ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа, выделения полисахарида из культуральной жидкости. Цель изобретения - снижение потерь полисахарида и сохранение его нативных свойс в. Культуральную жидкость, полученную при культивировании штамма Bacillus polymyxa 1459-В, нагревают при 75-85° С в присутствии 0,4-0,6 об. % формалина в течение 25-35 мин, отделяют биомассу и концентрируют жидкую фазу ультрафильтрацией. 1 табл.

ё

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения полисахарида из культуральной жидкости. Цель изобретения - снижение потерь полисахарида и сохранение его нативных свойств. Культуральную жидкость, полученную при культивировании штамма BACILLUS POLYTYXA 1459 - В нагревают при 75 - 85°С в присутствии 0,4 - 0,6 об.% формалина в течение 25 - 35 мин, отделяют биомассу и концентрируют жидкую фазу ультрафильтрацией. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа выделения полисахарида из культуральной жидкости.

Цель изобретения - снижение потерь полисахарида и сохранение его нативных свойств.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуральную жидкость, полученную при культивировании штамма Bacillus polymyxa 1459-B и содержащую 15-20 г/л1 полисахарида, нагревают при 75-85° С в присутствии 0,4-0,6 об. % формалина в течение 25-35 мин. Формалин используется в качестве коагулянта биомассы микроорганизма - продуцента полисахарида. Концен- трация формалина в культуральной жидкости и условия ее обработки таковы, что при осаждении биомассы не происходит

потерь полисахарида и не изменяются его нативные свойства.

В таблице приведены результаты обработки культуральной жидкости в разных условиях.

После обработки формалином от культуральной жидкости отделяют биомассу, а жидкость концентрируют ультрафильтрацией.

Свойства полученного полисахарида определяют следующим образом.

Динамическую вязкость т/дин. (сП) измеряют с помощью ротационного вискозиметра Rheomat-108 при скорости сдвига ,1 при 20° С (диапазон ,67- -1290с 1).

Псевдопластичность (область псевдопластического течения), т,е, уменьшение вязкости раствора с увеличением скорости сдвига вследствие ориентации макромолеО

о го о

кул в потоке, определяют как разницу /макс - мин , где 7макс - динамическая вязкость, измеренная при минимальной скорости сдвига 7,61 с (или минимально возможном значении D); т/Мин - динамиче- Јкая вязкость, измеренная при максимальной скорости сдвига 1290 т/дин - вязкость концентрата или раствора после предварительного нагревания до 90° С и охлаждения до 20° С.

Тиксотропность образцов, т.е. способность системы восстанавливать свою струк- туру (выражающуюся в увеличении вязкости) после снятия напряжения, оценивают по времени, необходимому для полного восстановления /ДИн . Для этого раствор помещают в измерительный стакан, опускают в него измерительную систему прибора и измеряют зязкость при скорости сдвига 17,1 с , затем задают максимальную скорость сдвига 1290 с и снова измеряют вязкость при 17,1 с через каждые 30 с, Фиксируют время, по прошествии которого восстонавливается исходная вязкость.

П р и м е р 1. Штамм B.polymyxa 1459-B культивируют на среде следующего соста- за, %:

Гидролизованный кукурузный крахмал 3 ( по РВ )

КН.Р04,0,05

К2НР040,05

MgSC 4 7H200,04

CaCl2-2H200,02

БВК0,5

В качестве источника углерода используют гидролизованный кукурузный крахмал, для получения которого кукурузный крахмал перемешивают с водой при 82±2 °С, рН 6,4±0,4, добавляют амилосуб- тилин (А 600 ед.) и выдерживают 90 мин, после чего смесь нагревают до 100° С и выдерживают 15 мин. После охлаждения смеси добавляют остальные компоненты, доводят объем среды до 10 л и стерилизуют. Ферментацию проводят в течение 48 ч в ферментере объемом 10 л при температуре 28±1° С, рН 7,1 ±0,3, аэрации 0,55 л/мин, и перемешивании 220 об/мин.

Посевной материал задают в количестве 5-10%. Для получения посевного материала используют среду указанного состава с содержанием гидролизованного кукурузного крахмала 1,5 об.% по РВ. 1 л культураль- ной жидкости нагревают при 70° С в течение 30 мин в присутствии 0,5 об.% формалина. Полученную суспензию разбавляют водой в 5 раз при 60° С, сепарируют, фугат концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, повторно разбавляют до

исходного объема и концентрируют в 10 раз Реологические характеристики: т/дин концентрата, разбавленного в 4 раза дистиллированной

водой (1 %)900 сП

Г} дшЮЮсП

макс - мин84° сП

Тиксотропность5 мин

Пример 2. 1л культуральной жидкости, полученной, как описано в примере 1, нагревают при 75° С в течение 30 мин в присутствии 0,5 об.% формалина. Затем полученную суспензию обрабатывают, как 5 описано в примере 1.

Реологические характеристики: Дин концентрата, разбавленного в 4 раза 1258 сП /дин1288сП

0Т/макс- мин1180СП

ТиксотропностьМгновенная

П р и м е р 3. 1 л культуральной жидкости, полученной,как описано в примере 1, нагревают при 80 С в течение 30 мин в присутствии 0,5 об.% формалина, затем полученную суспензию обрабатывают, как Описано в примере 1.

Реологические характеристики: /дин концентрата, разбавленного в

1430сП 1500сП

7макс-т/мин 1398сП

ТиксотропностьМгновенная

Пример 4. 1л культуральной жидкости, полученной,как описано в примере 1, нагревают при 85° С в течение 30 мин в присутствии 0,5 об.% формалина, затем полученную суспензию обрабатывают, как описано в примере 1.

Реологические характеристики: /дин концентрата, разбавленного в

4 раза1442 с Л

J/дин1502 сП

/макс- 7мин1400СП

ТиксотропностьМгновенная

Пример 5. 1л культуральной жидко- 0 сти- полученной,как описано в примере 1, нагревают при 80° С в течение 25 мин в присутствии 0,5 об.% формалина, затем полученную суспензию обрабатывают, как описано в примере 1. 5 Реологические характеристики: 7дин концентрата,, разбавленного в 4 раза1335 сП

г/ям1385сП

/макс- 7мин1229СП

0

5

0

5

4 раза

/Дин

ТиксотропностьМгновенная

Пример 6. 1л культуральной жидкости, полученной, как описано в примере 1, нагревают при 80° С в течение 35 мин в присутствии 0,5 об.% формалина, затем полученную суспензию обрабатывают, как описано в примере 1.

Реологические характеристики: /дин концентратал разбавленного в 4 раза1428 сП

J/дин1490сП

)/макс- 7мин1384СП

ТиксотропностьМгновенная

Пример. 1л культуральной жидкости, полученной,как описано в примере 1, нагревают при 80° С в течение 30 мин в присутствии 0,4 об.% формалина, затем полученную суспензию обрабатывают, как описано в примере 1.

Реологические характеристики: т/дин концентрата, разбавленного в 4 раза /дин

7/макс Т/мин

Тиксотропность

ПримерЗ. 1л культуральной жидкости, полученной, как описано в примере 1, нагревают при 80° С в течение 30 мин в присутствии 0,6 об.% формалина, затем полученную суспензию обрабатывают, как описано в примере 1.

Реологические характеристики: т/дин концентрата,

разбавленного в

4 раза1423 сП

1299 сП 1330 сП 1249сП Мгновенная

7/дин

1482 сП

/макс- 7мин -1389 СП

ТиксотропностьМгновенная

Результаты исследования показывают, что нагревание до 75° С не обеспечивает сохранения исходных свойств полисахаридов. Это объясняется недостаточной степенью очистки концентрата в результате неполной коагуляции клеток. Аналогичные результаты получены при прогревании в те- чение 25 мин и менее и снижении концентрации формалина до 0,4 об.% и ниже.

Увеличение температуры выше 85° С, продолжительности нагревания более 35 мин и концентрации формалина выше 0,6 об.% не приводит к дальнейшему улучшению свойств полисахаридов, но может вызвать разрушение его первичной структуры.

Формула изобретения

Способ выделения полисахарида из культуральной жидкости, включающий осаждение биомассы продуцента полисахарида при нагревании до 75-85° С в присутствии коагулянта с последующим отделением биомассы и концентрированием раствора полисахарида, отличающийся тем, что, с целью снижения потерь полисахарида и сохранения его нативных

свойств, в качестве коагулянта используют формалин, обработке формалином подвергают культуральную жидкость, содержащую в качестве продуцента полисахарида штамм бактерий Bacillus polymyxa ВКПМ № В 1459, и обработку ведут в течение 25-35 мин при концентрации формалина в культуральной жидкости 0,4-0,6 об.%.