Способ получения экзополисахарида Советский патент 1991 года по МПК C12P19/04 

1

(21)4647068/13;4647067/13

(22)04.01.89

(46) 15.12.91. Бюл. №46

(71)Ладыжинское производственное био- фармэцевтическое объединение Энзим и Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии

(72)В.В.Дерябин, Л.А.Старухина, Т.Д.Чистова, А.А.Бузин, Т.Ю.Матюхина, С.В.Яроц- кий, В.А.Болоховская, Л.Н.Шинкаренко, В.П.Сойченко, В.В.Болоховский, В.М.Бой- цун, И.Н.Игнатьева,-Р.Н.Белова, Е.В.Глухо- ва, Б.А.Шендеров, Н.Б.Мартынюк, В.Д.Иванов и Н.М.Подгорная (53)577.114(088.8)

(56)Патент Франции № 2551070, кл. С 08 В 37/00, 1985.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОПОЛИСА- ХАРИДА

(57)Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть

применено при получении высокоочищенных препаратов экзополисахаридов. Цель изобретения - увеличение прозрачности растворов экзополисахарида, а также увеличение их.тиксотропности. Культуральную жидкость Bacillus polymyxa ВКПМ В-3015 подвергают сушке на распылительной сушилке при температуре сушильного агента на входе 105-115°С с последующим диспергированием полученного порошка в воде, нагреванием дисперсии до 80-100°С в течение 25-35 мин, последующим сепарированием смеси и выделением целевого продукта из жидкой фазы спиртом или путем ультрафильтрации. Для повышения тик- сотролности после сепарирования раствор подщелачивают до рН 12,0 и выдерживают 25-35 мин при 80-100°С с последующей нейтрализацией раствора и выделением целевого продукта осаждением спиртом 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

хдавюгэ Lsss.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, биотехнологии и может найти применение при получении высокоочищенных препаратов экзополиса- харидов (ЭПС), отличающихся способностью к образованию прозрачных высоковязких гелеобразных растворов для использования в парфюмерно-косметиче- ской промышленности, медицинских и пищевых целях, фармацевтике.

Наиболее близким к изобретению является способ обработки ксантана для увеличения его вязкости и фильтруемости.

Недостатком этого способа является его неэффективность для культурэльной жидкости B.polymyxa B-3015, недостаточная прочность растворов и отсутствие геле- ообразующмх свойств.

Целью изобретения является увеличение прозрачности растворов экзогтолисаха- р°ида, а также увеличение их тиксотропносги.

Сущность изобретения заключается в том, что используют культуральную жидкость B.polymyxa ВКПМ В-3015, коагуляцию клеток в ней осуществляют путем распылительной сушки при температуре сушильного агента на входе 105°- 15°С, полученный порошок диспергируют в воде, нагревают дисперсию до 80-100°С, выдерживают в течение 25-35 мин, сепарируют смесь и выделяют целевой продукт из жидкой фазы осаждением спиртом или ультрафильтра- циёй. С целью увеличения тиксотропности растворов ЭПС после сепарирования раствор подщелачивают до рН 12,0 и выдерживают 25-35 мин при 80-100°С с

Ch

ю о©

ю со

«&

последующей нейтрализацией раствора с выделением целевого продукта осаждением спиртом.

Способ осуществляют следующим образом.

Культу рал ьную жидкость B.polymyxa, полученную при ферментации на гмдроли- зованном крахмале и содержащую 20 г ЭПС/г, разбавляют водой в 2 раза и сушат на распылительной сушилке (температура воздуха на входе 105-115°С, а на выходе - 55-60°С), Полученный порошок диспергируют в воде до концентрации 1-2% при перемешивании и нагревании до 45°С до получения однородной дисперсии и исчезновения комков. Затем полученный раствор выдерживают в течение 25-35 мин при 80- 100°С; образовавшийся осадок отделяют сепарированием или центрифугированием (). Из прозрачного фугата выделяют ЭПС осаждением спиртами или получают 1 %-ный концентрате помощью ультрафильтра ци и. Для получения гелеобразующего полисахарида и увеличения тиксотропности его растворов прозрачный фугат, полученный после сепарации и центрифугирования, выдерживают в течение 25-35 мин при рН 12 (10% NaOH) и температуре 80-100°С.

После охлаждения раствор нейтрализуют б н. H2S04 кислотой и осаждают ЭПС перемешиванием с изо-пропано- лом или этанолом Б соотношении 1:1,5 соответственно. Образовавшийся осадок промывают свежей порцией этанола и сушат в вакуумной или конвекционной сушилке при 40°С.

П р и м е р 1. Посевную культуру B.polymyxa (10 об.%) вносят в питательную среду, содержащую, об.%: гидролизован- ный кукурузный крахмал 3; БВК.0,5; КНаРСч 0,05; К2НРОЗН20 0.05; М СМ-7Н20 0,04; CaCl2 0,02, Питательная среда должна иметь следующие показатели: рН 7,1 ± 0,3; температура 28,2 ± 2 г/л, концентрация РВобщ. 28 ± 2 г/л, концентрация РВСв. не менее 9± 1 г/л, концентрация аминного азота 0,16 ± 0,02 г/л, концентрация белка 3,0 ± 0,5 г/л, отсутствие посторонних живых микроорганизмов.

Процесс микробиологического синтеза проводят в аппарате с рабочим объемом 100 дм3 при 28 ± 1°С, рН 7,1 ± 0,3, давлении в аппарате 0,45 ± 0,5 кгс/см , аэрации 0,55± 0,05 м3 воздуха/м3 среды в мин, скорости перемешивания 196 об/мин. Содержание ЭПС в полученной культуральной жидкости 18 г/л.

П р и м е р ы 2-17. 10 дм культуральной жидкости B.Poiymyxa полученной как описано в примере 1, разбавляют водой до 20 дм3 и сушат на распылительной сушилке при температуре сушильного агента из UXQ- де 100-125°С. Порошок (500 г) растворяют

при перемешивании в25 дм3 воды, нагревают до 70-100°С и выдерживают при этой температуре в течение 20-40 мин. Образовавшийся осадок отделяют сепарированием.

Фугат смешивают с этанолом (или изопропанолом) в соотношении 1:1,5, образовавшийся осадок ЭПС отделяют, промывают этанолом и сушат в вакууме; для получения ЭПС в виде концентрата фугат

ультраконцентрируют до содержания ЭПС 1%, Для получения гелеобразующего ЭПС фугат подщелачивают до рН 10-13 и выдерживают при 70-100°С в течение 20-40 мин. После охлаждения до 25-30°С раствор нейтрализуют 6 н. H2S04 кислотой. К раствору приливают изопропанол (в соотношении 1:1,5), промывают этанолом и сушат з ваку- умной или конвекционной сушилке.

Из полученных препаратов сухих зкзополисахаридов (170-189 г) готовят 1 %-ный раствор и определяют параметры дисперсности: мутность т (см), вязкость ц дин (Па-с), тиксотропность. Эти же параметры определяют для 1%-ных концентратов ЭПС.

П р и м е р 18. 1 дм культуральной

жидкости B.polymyxa, полученной как опи- . сано в примере 1, разбавляют в 2 раза водой, нафевают до 140°С и выдерживают при данной температуре 30 мин. Полученный осадок отделяют сепарированием или центрифугированием з тех же условия/, что и в примерах 2-17. Далее фугат обрабатывают аналогично примерам 2-17.

П р и м е р 19. 1 дм культурзльной

жидкости B.polymyxa, полученной как описано в примере 1, разбавляют в 2 раза водой, нагревают до 100°С и выдерживают при данной температуре и рН 5,5 в течение 15 мин. Далее центрифугируют и осаждают

5 супернатант изопропанолом в соотношении 1:2 соответственно. Осадок полисахарида отделяют на фильтре и сушат в вакууме при40°С,

0Пример 20. Культуральную жидкость

Bac.polymyxa обрабатывают аналогично описанным примерам. Порошок, полученный после распылительной сушки 500 г, растворяют .при перемешивании в 25 дм3 воды

5 и выдерживают при 90°С в течение 30 мин. Образовавшийся осадок отделяют сепарированием. Фугат концентрируют на ультра- фильтрационной установке БТУ-1 до концентрации ЭП 1 %. Этот концентрат анализируют на вязкость и мутность: ,;ин.вязкость ,86 Па-с, мутность г- 0,380 1/см. иПри нагреве в течение 35 мин rj 0,876 Па.с,г 0,365 1/см. Вязкость проверяют на ротационной вискозиметре РЕОМАТ-108.

Данные экспериментов представлены в табл.1,

Как видно из табл.1 (примеры 2-7), использование сушильного агента с температурой на входе ниже 105°С приводит к образованию влажных комков в результате склеивания частиц, что дает резкое увеличение мутности ( г) и, следовательно, уменьшение прозрачности растворов. При этом существенно увеличивается время растворения препарата полисахарида и несколько уменьшается вязкость раствора. Увеличение температуры сушильного агента выше 115°С нецелесообразно, так как время растворения и мутность раствора препарата при этом не уменьшаются, а вязкость раствора не увеличивается, но возрастает расход энергии на нагрев сушильного агента.

Сокращение времени нагрева раствора до 20 мин (примеры 8-12) приводит к недостаточной коагуляции клеток продуцента в растворе, что затрудняет их дальнейшее отделение. Растворы, образующиеся из конечного продукта, имеют небольшую вязкость и большое значение параметра (пример 8). Увеличение времени нагрева до 40 мин также нецелесообразно, так как не приводит к улучшению показателей вязкости и прозрачности (примеры 11, 12).

Уменьшение температуры нагрева раствора ниже 70°С ухудшает эффективность коагуляции клеток продуцента в растворе, а увеличение ее выше 85°С лишь незначительно улучшает показатели tj дин. раствора конечного продукта и не оправдывает энергозатраты. Все препараты обладали практически мгновенной тиксотропностью (не более 3 с).

В тчбл.2 представлены значения параметров дисперсности (мутности числа дисперсных частиц N, массовой концентрации дисперсных частиц С, г/см3; радиуса дисперсных частиц г, мкм) растворов различной концентрации: пектина яблочного (фармахим); ксантана (Sigma); полисахарида B.poiymyxa, полученного по предлагаемому способу.

Наименьшее значение т имеют растворы B.poiymyxa при всех рассмотренных кон центрациях, при этом значения г раствороз B.poiymyxa на порядок ниже, чем у ксантана Ь и пектина, Мутность (г) растворов полисаха- jjvflcn B.poiymyxa в отличие от ксантана и пьктина увеличивается крайне медленно с ростом концентрации полимера в растворе, что указывает на хорошую растворимость 0 первого в воде. Концентрация диспершро- ганного (нерастворившегося) вещества (С) у полисахаридов B.poiymyxa на порядок ни- же, чем у ксантана и пектина. Размер частиц диспергированных полимерных агрегатов 5 В polymyxa в растворе меньше, а их число больше, чем у ксантана и пектина.

Растворы ЭПС (по примеру 5), полученные после сепарчрсвания, выдерживают в течение 20-40 мин при 70-- i000C при рН

0 10-13. Полученные результаты представлены в табл.3. Эффективность обработки контролируют по динамической вязкости 1 %-ных растворов и их тмксотропности. Таким образом, оптимальными пара5 метрами щелочной обработки являются рН 12,0 температура 90°С, время выдержки 30 мин.

Формула изобретения

0 включающий коагуляцию клеток в культу- ралькой жидкости и их отделение, о т л и ч а- ю щ и и с я тем, что, с целью увеличения прозрачности растворов экзополисахарида, используют кульгуральчую жидкость

5 Bacillus poiymyxa ВКПМ В-3015, коагуляцию к пето к в ней осуществляют путем распылительной сушки при температуре сушильного агента н& входе 105-115°С, полученный по- оошок диспергируют в воде, нагревают дис0 Персию, до 80-100°С, выдерживают в течение 25-35 мин, сепарируют смесь и выделяют целевой продукт из жидкой фазы осаждением спиртом или ультрафильтрацией,

5 2, Способ по п,1,отличающийся тем, чго, с целью узепичения тиксотропно- сти растворов экзополисахарида, после сепарирования раствор подщелачивают до рН 12,0 и выдерживают в течение 25-35 мин

0 при 80-100°С с последующей нейтрализацией раствора с выделением целевого продукта осаждением спиртом.

рН 5,5.

Т а б л и ц а 1

Таблица2

ТаблицаЗ

Продолжение табл..