ШТАММ БАКТЕРИЙ PARACOCCUS DENITRIFICANS - ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА И ЭКЗОПОЛИСАХАРИД Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12R1/01 C08B37/00 

Изобретения относятся к микробиологической промышленности и касаются новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высокомолекулярный экзополисахарид, который может найти применение в ряде отраслей промышленности, в том числе строительной, бумажной, текстильной, парфюмерно-косметической, пищевой, химической, нефте- и газодобывающей, в сельском хозяйстве, а также в фармацевтике и медицине.

Из уровня техники известны бактериальные культуры - продуценты экзополисахаридов (далее - ЭПС), такие как Xanthomonas campestris NRLL B-1459 (US 4049054, 1977), Xanthomonas campestris NRLL B-12075 и NRLL B-12074 (US 4400467, 1983), Xanthomonas campestris ATCC-31601 (US 4418145, 1983), Pseudomonas elodea, Acinetobacter sp. (SU 1522750, 1987), Acinetobacter sp. ВКПМ B-3243 (SU 1579059, 1990), Bacillus polimyxa B-4556 (RU 1826520, опубл. 2004) и др.

Однако, как правило, продуцируемые названными штаммами экзополисахариды обладают недостаточными структурирующими свойствами как в водных, так и в углеводородсодержащих водных средах, некоторые штаммы являются фитопатогенными (Xanthomonas campestris 8162), патогенными (Р. aeruginosa), некоторые - генетически нестабильны (Pseudomonas elodea, Acinetobacter sp.), диссоциируют на мукоидные и немукоидные формы, большая естественная изменчивость указанных штаммов влечет за собой нестабильность выхода и качества синтезируемых ЭПС.

Известен штамм бактерий Azotobacter vinelandi (Lipman) ВКПМ В-5933, продуцирующий высокомолекулярный экзополисахарид (RU 2073712, кл. C12N 1/20, 1993).

Однако водные растворы и углеводородсодержащие водные системы продуцируемого указанным штаммом экзополисахарида обладают недостаточно высокими реологическими характеристиками.

Предметом изобретения является новая не являющаяся генетически модифицированной стабильная аэробная культура бактериальных микроорганизмов, относящихся к виду Paracoccus denitrificans, продуцирующих высокомолекулярный экзополисахарид.

Данная культура бактериальных микроорганизмов выделена из активного ила станции биологической очистки сточных вод нефтеперерабатывающего предприятия. Идентификация выделенной культуры была осуществлена на основании изучения ее культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey's "Manual of Systematic Bacteriology". Была также проведена идентификация культуры до вида Paracoccus denitrificans с помощью анализа 16S рДНК. Селекционным путем, методом последовательного ступенчатого отбора вариантов, был получен новый штамм бактерий Paracoccus denitrificans, задепонированный как штамм бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 - продуцент экзополисахарида.

В активной фазе клетки типового штамма Paracoccus denitrificans представляют собой кокковидные палочки размером 0,5-0,9÷0,9-1,2 мкм. Бактериальные клетки образуют колонии белого цвета. Отсутствует необходимость в дополнительных факторах роста, штамм не растет на средах, содержащих метанол. Типовой штамм Paracoccus denitrificans не патогенен для растений.

Новый штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 характеризуется следующими признаками. В активной фазе клетки Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 представляют собой толстые короткие палочки размером 1-1,5÷1,5-2,0 мкм. Бактериальные клетки образуют колонии опалового цвета. Существует необходимость в дополнительных факторах роста (дрожжевой экстракт и пантотеновая кислота), растет на средах, содержащих метанол. Штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 не патогенен для мышей.

Новый штамм размножается при 20-29°С; хранится при +4°С на скошенном глюкозо-картофельном агаре или сусло-агаре. Среду стерилизуют при 0,75 атм и температуре 110°С. Частота пересевов - 1 раз в 4-5 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617.

Клетки бактерий грамотрицательные, неподвижные. В логарифмической фазе культура представляет собой толстые короткие палочки, в стационарной - коккоиды, расположенные парами, реже - в коротких цепочках. Спор не образуют. Размножение клеток осуществляется путем бинарного деления.

При росте на сусло-агаре или на скошенном глюкозо-картофельном агаре штамм образует выпуклые блестящие слизистые опаловые колонии правильной формы, 4-6 мм в диаметре. При росте на жидкой среде с этанолом, в качестве единственного источника углерода, образует высоковязкую тягучую суспензию светло-кремового цвета. При многократном рассеве на твердой богатой сахаросодержащей среде диссоциация штамма не была обнаружена. Стабильной является мукоидная форма бактериальных клеток, синтезирующая стабильный продукт со стабильных выходом. Колониально-морфологическая изменчивость - единообразие клеток.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Каталазоположительный, оксидазоотрицательный, кислотонеустойчивый. Имеется супероксидисмутаза, пероксидаза отсутствует. Температурный диапазон роста 10-42°С. Оптимальная температура роста 24-30°С, рН 5,5-8,0, оптимум рН 7,0. Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует. Молоко не сбраживает. Нитраты не восстанавливает, сероводород, индол и ацетоин не образует.

Отношение к источникам углерода.

Растет на этаноле, пропаноле, пирувате, ацетате, цитрате, фумарате, глюкозе, фруктозе, лактате, сукцинате, оксалате, гексадекане. Слабо растет на сахарозе, мальтозе, лактозе. Не растет на рамнозе, ксилозе, глицерине, целлюлозе. При метаболизме глюкозы функционируют гликолиз и КДФГ-путь.

Отношение к источникам азота.

Использует неорганические и органические источники азота - соли аммония, нитраты, мочевину, пептон. Атмосферный азот фиксирует в микроаэрофильных условиях.

Отношение к факторам роста.

Ауксотроф, нуждается в дополнительных факторах роста - в дрожжевом экстракте и пантотеновой кислоте.

Минимальные, подавляющие рост, концентрации антибиотиков: тетрациклин - 1 мкг/мл, ампициллин - 1 мкг/мл, канамицин - 1 мкг/мл.

Штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ B-8617 относится к микроорганизмам, не патогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных в Санитарных правилах СП 1.2.731-99.

Условия культивирования.

Штамм культивируется в аэробных условиях. Оптимум рН 7,0. Растет на средах, содержащих углеводы. Использует неорганические и органические источники азота. Нуждается в дополнительных факторах роста.

Ниже приведен перечень компонентов питательной среды для культивирования Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 (мас.%).

KH₂PO₄·3H₂O0,1-2NaCl0,05-1NH₄NO₃·2H₂O0,1-2MgSO₄·7H₂O0,01-1FeSO₄·7H₂O0,0001-0,01CaCl₂·2H₂O0,005-0,05Пантотеновая кислота0,0001-0,001Дрожжевой экстракт0,001-0,1Глюкоза0,5-5.

В качестве дополнительного источника углерода используют этанол в количестве от 0,5 до 2 об.% на 100 об.% питательной среды.

Возможно получение экзополисахарида с идентичными свойствами на альтернативной питательной среде, достоинством которой является ее дешевизна по сравнению с вышеуказанной.

Ниже приведен перечень компонентов альтернативной питательной среды для культивирования Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 (мас.%).

КН₂PO₄·3H₂O0,1-2NaCl0,05-1NH₄NO₃·2H₂O0,01-0,5MgSO₄·7H₂O0,01-1CaCl₂·2H₂O0,005-0,1Водадо 100.

В качестве источников углерода и факторов роста использовались этанол в количестве 1,5 об.% и молочная сыворотка в количестве 30 об.%.

Культивирование Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 для получения экзополисахарида осуществляют в ферментаторе при температуре 28-40°С в условиях аэрации и перемешивания при концентрации растворенного кислорода 20-40%, рН среды - 7,0, в течение 24-48 часов. Продуктивность штамма в описанных выше условиях оптимальна и составляет по биомассе (5,5±0,8)×10⁸ клеток/мл, по количеству синтезируемого ЭПС - от 6 до 10 г/л.

Продуцируемый штаммом бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 экзополисахарид выделяли из культуральной жидкости и очищали нижеописанным способом. Культуральную жидкость, содержащую ЭПС, диализовали против дистиллированной воды в течение 5 дней. Затем разводили дистиллированной водой в 3 раза и отделяли клетки ультрацентрифугированием. Супернатант концентрировали в вакууме при небольшом подогреве до начального объема, после чего ЭПС осаждали добавлением изопропанола. Осадок ЭПС промывали чистым изопропиловым спиртом и высушивали при температуре 40°С.

Выделенный описанным способом ЭПС представляет собой массу перепутанных коротких волокон (до 15 мм) от светло-желтого до белого цвета влажностью 10-12% и содержанием полисахарида 95-99%.

Экзополисахарид образован остатками глюкозы, галактозы, маннозы, рамнозы (соответственно 5:2:4:1), включает в свой состав глюкуроновую и пировиноградную кислоты, а также ацильные группы. Молекулярная масса экзополисахарида, определенная гель-фильтрацией на Sephadex G-200 (Швеция), лежит в 0,5×10⁶-2×10⁷ Д.

Экзополисахарид растворяется в воде и полярных органических растворителях, таких как диметилформамид и диметилсульфоксид, образуя высоковязкие истинные растворы. Водные растворы экзополисахарида обладают псевдопластичностью и тиксотропией. При увеличении концентрации водного раствора экзополисахарида до 0,1% резко возрастает его кинематическая вязкость.

ЭПС осаждается из водных растворов спиртами (например, метанолом, этанолом, изопропанолом) и кетонами, например ацетоном. Добавление в водный раствор ЭПС неорганических солей (CaCl₂) приводит к выделению или так называемому высаливанию ЭПС.

Характерным свойством продуцируемого штаммом бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 экзополисахарида является его способность к структурированию не только водных, но и углеводородсодержащих систем. При смешении водных растворов ЭПС (0,2-0,7%) с нормальными углеводородами (С₆-С₁₂), например, при объемном соотношении соответственно 1:9 образуется стабильная, не расслаивающаяся во времени эмульсия, характеризующаяся псевдопластичностью и тиксотропией. Динамическая вязкость таких эмульсий при скорости сдвига 3 с^-1 составляет 2500-4000 мПа·с.

Примечательным (и существенным для использования в ряде областей производства) свойством продуцируемого штаммом бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 полисахарида является независимость динамической вязкости (при малых скоростях сдвига) его водных растворов от температуры раствора вплоть до 90°С.

Реологические свойства водных растворов практически не изменяются и при неоднократном предварительном их нагревании вплоть до 130°С с последующим охлаждением до исходной температуры (обычно 20°С).

Примечательными свойствами данного полисахарида являются также его пленкообразующие и волокнообразующие свойства.

Следующие примеры только демонстрируют изобретения, но не ограничивают их.

Пример 1

Приготовление твердой питательной среды (для размножения колонии клеток, а также для хранения): 500 г картофеля кипятили в течение 25 минут в 1 литре воды. Затем отвар декантировали, доводили кипяченой водой до 1 литра и вносили 20 г агара и 10 г глюкозы. Полученную питательную среду стерилизовали под давлением 0,75 атм и температуре 110°С. После стерилизации питательную среду еще горячей разливали в стерильные чашки Петри и предоставляли время для остывания.

После рассева на полученной питательной среде вырастают блестящие слизистые опаловые колонии Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617, колонии имеют правильную форму, 4-6 мм в диаметре, с культурально-морфологическими признаками, полностью совпадающими с описанными выше.

Пример 2

Экзополисахарид продуцировали в жидкой питательной среде, состав которой приведен ниже.

KH₂PO₄·3H₂O0,79NaCl0,19NH₄NO₃·2H₂O0,75MgSO₄·7H₂O0,52FeSO₄·7H₂O0,003CaCl₂·2H₂O0,008Пантотеновая кислота0,0006Дрожжевой экстракт0,05Глюкоза3Водадо 100.

В качестве дополнительного источника углерода вводили 1 объем этанола на 100 объемов питательной среды. Культивирование осуществляли при 28°С, рН 7, содержании кислорода 15-45%, в течение 36 часов.

По окончании процесса культуральная жидкость имела рН 7,3 и содержала 0,5% ЭПС.

Культуральная жидкость обладала псевдопластичностью и тиксотропией и при исследовании реологических характеристик показала следующие свойства:

эффективная вязкость при низких скоростях сдвига (3 с^-1) - 3200 мПа·с;

эффективная вязкость при высоких скоростях сдвига (1312 с^-1) - 10 мПа·с;

пластическая вязкость - 12 мПа·с;

критическое напряжение сдвига - 160 дПа;

коэффициент нелинейности - 0,33.

Для выделения полисахарида культуральную жидкость диализовали против дистиллированной воды в течение 1 суток, затем в 2 раза разводили дистиллированной водой и центрифугированием (30000 об/мин, 30 мин) отделяли клетки. Супернатант концентрировали под вакуумом при 50°С до начального объема, после чего ЭПС осаждали добавлением 1,5 объема изопропанола, фильтровали, промывали чистым изопропанолом и высушивали при температуре 40°С до постоянного веса. Полученный ЭПС представлял собой массу перепутанных коротких волокон (до 15 мм) от светло-желтого до белого цвета с влажностью 10% и содержанием полисахарида 99%.

Молекулярная масса полученного полисахарида, определенная гель-фильтрацией на Sephadex G-200 (Швеция), составляла 0,5×10⁶-2×10⁷ Д.

Пример 3

Полисахарид, полученный и выделенный по примеру 2, размалывали до порошкообразного состояния и исследовали реологические характеристики его водных растворов:

водные растворы ЭПС псевдопластичны и тиксотропны;

динамическая вязкость водных растворов ЭПС снижается при увеличении скорости сдвига;

эффективная вязкость 0,5% водного раствора при 3 с^-1 составляла 3000 мПа·с, при 5,4 с^-1 - 2500 мПа·с, при 9 с^-1 - 1312 мПа·с, при 27 с^-1 - 600 мПа·с, при 1312 с^-1 - 12 мПа·с;

пластическая вязкость - 17 мПа·с;

критическое напряжение сдвига - 130 дПа;

коэффициент нелинейности - 0,35.

Пример 4

Водный раствор ЭПС полностью восстанавливает динамическую вязкость после снятия механической нагрузки.

Эффективная вязкость 0,5% водного раствора ЭПС при скорости сдвига 3 с^-1 составила 3000 мПа·с, скорость сдвига увеличили до 1312 с^-1, и эффективная вязкость испытуемого раствора снизилась до 12 мПа·с. После снятия нагрузки испытуемый раствор выдерживали 10 минут в состоянии покоя и вновь измерили его эффективную вязкость в исходных условиях при скорости сдвига 3 с^-1, значение эффективной вязкости вновь составило 3000 мПа·с.

Пример 5

Данный пример демонстрирует независимость динамической вязкости 0,5% водного раствора ЭПС от температуры в интервале 20-90°С.

Вязкость 0,5% водного раствора полисахарида до нагревания (20°С) составляла 3000 мПа·с, во время нагревания (90°С) - 2700 мПа·с и после нагревания (20°С) - 2900 мПа·с.

Нагревание осуществляли на водяной бане, достоверные данные получали при максимальной температуре измерения 90°С. Нагревание и охлаждение раствора осуществляли без нагрузки.

Пример 6

0,5% водный раствор полисахарида нагревали в автоклаве при температуре 130°С в течение 2 часов. После нагревания до 130°С и измерения динамической вязкости раствор постепенно охлаждали до температуры 20°С и вновь измеряли его динамическую вязкость. Эффективная вязкость данного раствора при скорости сдвига 3 с^-1 до нагревания составляла 3000 мПа·с, а после нагревания и охлаждения эффективная вязкость при той же скорости сдвига (3 с^-1) составила 2890 мПа·с.

Пример 7

Готовили смесь, содержащую 1 объем 0,5% водного раствора ЭПС, полученного по примеру 2, и 9 объемов н-додекана. Смесь встряхивали в течение 3 минут, в результате образовалась эмульсия, характеризующаяся следующими показателями: эмульсия не расслаивалась в течение 4-х недель и имела эффективную вязкость при низких скоростях сдвига (3 с^-1) 3600 мПа·с; а при высоких скоростях сдвига (1312 с^-1) - 20 мПа·с.

Пример 8

Готовили эмульсию, как в примере 8, содержащую 1 объем 0,5% водного раствора ЭПС, полученного по примеру 2, и 9 объемов н-гептана, и снимали ее динамические характеристики:

эффективная вязкость при низких скоростях сдвига (3 с^-1) - 2500 мПа·с;

эффективная вязкость при высоких скоростях сдвига (1312 с^-1) - 14 мПа·с.

После снятия нагрузки эмульсию хранили в состоянии покоя в течение месяца расслоения эмульсии зафиксировано не было.

Пример 9

Динамическую вязкость водных 0,05% растворов полисахарида, продуцируемого штаммом Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617, исследовали на ротационном вискозиметре Brookfield при скоростях сдвига 0,06 с^-1, 0,11 с^-1 и 0,28 с^-1 и полученные данные сравнивали с аналогичными результатами по прототипу.

Динамическая вязкость 0,05% раствора полисахарида, продуцируемого штаммом Paracoccus demtrificans ВКПМ В-8617, при скоростях сдвига 0,06 с^-1, 0,11 с^-1 и 0,28 с^-1 составили 1320 мПа·с, 867 мПа·с и 675 мПа·с соответственно. Динамическая вязкость 0,05% раствора полисахарида, продуцируемого штаммом Azotobacter vinelandi (Lipman) ВКПМ В-5933 (прототип), при скоростях сдвига 0,06 с^-1, 0,11 с^-1 и 0,28 с^-1 составили 420 мПа·с, 220 мПа·с и 144 мПа·с соответственно.

Изобретения относятся к микробиологической промышленности и касаются новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высокомолекулярный экзополисахарид, который может найти применение в строительной, бумажной, текстильной, парфюмерно-косметической, пищевой, химической, нефте- и газодобывающей промышленности, в сельском хозяйстве, а также в фармацевтике и медицине. Штамм бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617, который продуцирует экзополисахарид, обладающий структурирующими свойствами в водных и водосодержащих углеводородных системах. Экзополисахарид образован остатками глюкозы, галактозы, маннозы, рамнозы при соотношении 5:2:4:1 соответственно, включает глюкуроновую и пировиноградную кислоты, а также ацильные группы и имеет молекулярную массу 0,5·10⁶-2·10⁷ Д. Экзополисахарид способен образовывать псевдопластичные и тиксотропные высоковязкие водные растворы со стабильными значениями динамической вязкости в диапазоне температур от 20 до 90°С и нерасслаивающиеся эмульсии. 2 н.п. ф-лы.

1. Штамм бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ-В 8617 - продуцент экзополисахарида.2. Экзополисахарид, обладающий структурирующими свойствами в водных и водосодержащих углеводородных системах, отличающийся тем, что получен из штамма бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617, образован остатками глюкозы, галактозы, маннозы, рамнозы при соотношении 5:2:4:1 соответственно, включает глюкуроновую и пировиноградную кислоты, а также ацильные группы и имеет молекулярную массу 0,5·10⁶-2·10⁷ Д.