Способ получения бактериального альгината Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12P19/00 C12R1/65 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению бесцветного бактериального полисахарида альгинатного типа, склонного к гелеобразованию в присутствии ионов кальция.

Альгинаты используются в качестве загустителей и стабилизаторов, носителей для иммобилизации клеток, ферментов. В присутствии ионов кальция альгинат способен образовывать биосовместимый гидрогель, что позволяет использовать его в мясоперерабатывающей промышленности в качестве съедобных плёнок для колбас, в фармацевтической промышленности как матрицу для водорастворимых лекарственных средств в составе раневых покрытий. Основным методом производства альгината является его выделение из бурых морских водорослей. При этом основная часть патентов при использовании данного метода представляет из себя различные способы выделения альгината из сборного водорослевого сырья, которые незначительно отличаются стадиями производства, химическими веществами, используемыми как при подготовке водорослевого сырья, так и при высаживании альгиновой кислоты. Например, в патенте RU 2030885 предполагается использование на этапах подготовки сырья кислой среды рН=3, а на этапе высаживания обработка проводится слабым кислотным раствором. В патенте RU 2197840 в качестве кислотного и щелочного реагентов используют электрохимически активированные растворы – анолит и католит. Использование водорослей как источника альгината часто не предполагает самостоятельное культивирование сырья в первую очередь ввиду продолжительности процесса. В отличие от этого бактериальный биосинтез, в свою очередь, имеет следующие преимущества: упрощенная технологическая схема производства, экологичные методы выделения, независимость от сезона и географического расположения. Стоит отметить и то, что скорость культивирования бактерии существенно выше, чем у водорослей.

Известен способ получения экзополисахарида в количестве 16 г/л при культивировании бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 1 в течение 48 ч в условиях интенсивной аэрации (200 об/мин) на среде Федорова с добавлением мелассы в качестве источника углерода (RU 2266324, МПК C12N 1/20, C12P 19/04, C12N 1/20, C12R 1/065, опубл. 20.12.2005).

Главным недостатком метода является использование мелассы в качестве источника углерода, что сильно влияет на цветность и чистоту полисахарида, ограничивая область его применения.

Известен метод биосинтеза экзополисахарида посредством выращивания штамма Panibacillus polymyxa 1459-В ВКПМ В-3015 (RU 1698293, МПК С12Р 19/04, опубл. 15.12.1991).

Недостатком способа является то, что полученный полисахарид является слабым гелеобразователем, а потому не может быть использован при приготовлении гидрогелей.

Известен штамм бактерий Azotobacter vinelandii (Lipman) ВКПМ В-5933 который производит экзополисахарид альгинатного типа.

И хотя указанный штамм способен производить до 10 г/л экзополисахарида, его недостаток заключается в низком выходе целевого продукта сравнительно с аналогичными работами (RU 2073712, МПК C12N 1/20, C12P 19/04, C12N 1/20, C12R 1/065, опубл. 20.02.1997).

Наиболее близким решением к заявленному является способ получения альгината путём культивирования бактерий Azotobacter vinelandii ИБ-1. Сущность данного изобретения состоит в том, что на питательной среде Федорова, содержащей смесь микроэлементов и мелассу, культивируют бактерии Azotobacter vinelandii ИБ-1 при температуре 25°С в течение 48 ч и скорости перемешивающего устройства 300 об/мин, содержание мелассы при этом в питательной среде – 60,0 г/л, аэрации – 0,5 объема воздуха на 1 объем среды в минуту. Выделение экзополисахарида осуществляют при помощи осаждения изопропиловым спиртом в количестве 70% по объему. Выход полисахарида составляет при этом 25 г/л (RU 2359028, МПК C12N 1/20, C12P 19/00, C12R 1/065, опубл. 20.06.2009).

Недостатком данного способа является использование мелассы в качестве источника углерода, что влияет на цвет и чистоту полисахарида, ограничивая применение в пищевой и фармацевтической промышленности.

Задачей изобретения является получение бактериального альгината, склонного к гелеобразованию в присутствии ионов кальция, при культивировании Azotobacter vinelandii 16 ВКПМ В–10436.

Технический результат заключается в повышении эффективности получения бактериального альгината, способного к гелеобразованию в присутствии ионов кальция и не имеющего окраса ввиду бесцветности среды культивирования, что облегчает его очистку и тем самым благоприятно сказывается на широте потенциального применения.

Сущность изобретения заключается в культивировании Azotobacter vinelandii 16 ВКПМ В–10436 на среде Эшби с различной концентрацией сахарозы в течение 3 суток при температуре 30°С и скорости вращения перемешивающего устройства 250 об/мин в аэробных условиях. Культуральную жидкость отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 45 мин., полисахарид осаждают из супернатанта абсолютированным изопропиловым спиртом в соотношении 2:1, после чего лиофилизируют.

На фиг. 1 изображен ИК-спектр альгината A. vinelandii 16, на фиг. 2 изображен ИК-спектр водорослевого альгината; ИК спектры получены с помощью ИК-Фурье спектрометра IRPrestige-21, Shimadzu (Япония). В таблице представлены динамика накопления альгината на среде Эшби в зависимости от концентрации сахарозы и времени культивирования.

Способ получения бактериального альгината заключается в следующем.

Для поддержания культуры посевной материал и Azotobacter vinelandii 16 ВКПМ В–10436 выращивают на агаризованной картофельной L-среде, содержащей следующие компоненты (в г/л): дрожжевой экстракт 5; пептон 15; NaCl 5; агар-агар 15; картофель 200.

Для этого 200 грамм картофеля отваривают в течение 20 мин в 1000 мл воды, после чего фильтруют через марлю для отделения картофельной массы. Полученный отвар используется как дисперсионная среда для остальных компонентов питательной среды.

Инокулят готовят следующим образом: с посевного материала, представляющего собой культуру микроорганизмов на скошенном агаре картофельной L-среды, проводят смыв 10 мл засеваемой питательной среды в стерильных условиях. Полученной суспензией микроорганизмов засевают 100 мл питательной среды и проводят культивирование на шейкере-инкубаторе «Environmentalshaker – incubatorЕS – 20/60» при температуре 30°С и скорости вращения перемешивающего устройства 250 об/мин на протяжении 3 суток.

Культирование проводят на среде Эшби следующего состава (в г/л): NaCl 0,2; K₂HPO₄ 0,1; MgSO₄ 0,2; K₂SO₄ 0,1; CaCO₃ 5. В качестве источника углерода используется сахароза. В подготовленную среду вводят 10% инокулята в стерильных условиях и культивируют в течение 2 суток на шейкере-инкубаторе «Environmentalshaker – incubatorЕS – 20/60» при температуре 30°С и скорости вращения перемешивающего устройства 250 об/мин аэробных условиях. Культуральную жидкость отделяют от биомассы центрифугированием при 7000 об/мин в течение 45 мин. Затем полисахарид осаждают из супернатанта абсолютированным изопропиловым спиртом в соотношении 2:1, после чего лиофильно высушивают. Полученный альгинат представляет собой мелкодисперсный порошок белого цвета.

Пример 1.

Культивирование происходит на среде Эшби со следующим составом (в г/л): NaCl 0,2; K2HPO4 0,1; MgSO4 0,2; K2SO4 0,1; CaCO3 5; сахароза 50, 60, 70. В подготовленную среду добавляют 10 % инокулята в стерильных условиях и культивируют в течение 3 дней при температуре 30°C и скорости вращения 250 об/мин перемешивающего устройства в аэробных условиях. Затем культуральную жидкость центрифугируют при 7000 об/мин в течение 45 минут для отделения биомассы. Полисахарид осаждают из супернатанта абсолютным изопропиловым спиртом в соотношении 2:1, после чего лиофильно высушивают.

Согласно таблице, наибольший выход полисахарида достигается на третий день культивирования при концентрации сахарозы 60 г/л и составляет 15,08 г/л. Однако более оптимальным является культивирование в течение 2-х суток, выход в таком случае составляет 14,78 г/л.

Пример 2.

Культивирование происходит на среде Эшби со следующим составом (в г/л): NaCl – 0,2; K2HPO4 – 0,1; MgSO4 – 0,2; K2SO4 – 0,1; CaCO3 – 5; сахароза – 60. Выделение альгината соответствует примеру 1.

Соответствие полученного полисахарида альгинату проверяли по ИК-спектрам полученным с помощью ИК-Фурье спектрометра IRPrestige-21, Shimadzu (Япония). Таким образом, на фиг. 1 ИК спектр альгината A. vinelandii 16, на фиг. 2 ИК-спектр водорослевого альгината, используемого в качестве эталона.

Пример 3.

Биосинтез и выделение альгината соответствует примеру 2.

Исследование гелеобразования проводили с помощью 20% раствора СаCl₂. Раствор альгината по каплям вносят в CaCl₂, наблюдая за образованием геля. Концентрации полисахарида в 3% достаточно для образования крупнозернистого геля.

По сравнению с другими известными решениями предлагаемый способ позволяет эффективно получать бактериальный альгинат, способный к гелеобразованию в присутствии ионов кальция и не имеющий окраса ввиду бесцветности среды культивирования, что облегчает его очистку и тем самым благоприятно сказывается на широте потенциального применения.

Таблица

Сахароза, % Время роста, сут. 1 2 3 Повтор Ср, г/л Повтор Ср, г/л. Повтор Ср., г/л 5 4,52 4,56±0,13 7,66 7,10±0,29 5,58 5,26±0,19 4,82 6,64 5,30 4,36 7,00 4,90 6 7,74 7,67±0,14 14,44 14,78±0,21 15,18 15,08±0,14 7,40 15,18 15,26 7,88 14,74 14,80 7 7,08 6,88±0,10 11,40 11,86±0,32 10,26 10,30±0,03 6,88 12,48 10,36 6,70 11,72 10,28

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения бактериального альгината, заключающийся в культивировании Azotobacter vinelandii 16 ВКПМ В–10436 на среде Эшби со следующим составом, в г/л: NaCl 0,2; K₂HPO₄ 0,1; MgSO₄ 0,2; K₂SO₄ 0,1; CaCO₃ 5; с концентрацией сахарозы 50, 60, 70 г/л в течение 3 сут при температуре 30°С и скорости вращения перемешивающего устройства 250 об/мин в аэробных условиях с последующим отделением культуральной жидкости центрифугированием при 7000 об/мин в течение 45 мин, при этом полученный полисахарид осаждают из супернатанта абсолютированным изопропиловым спиртом в соотношении 2:1, после чего лиофилизируют. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения бактериального альгината, способного к гелеобразованию в присутствии ионов кальция и не имеющего окраса ввиду бесцветности среды культивирования. 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ получения бактериального альгината, заключающийся в культивировании Azotobacter vinelandii 16 ВКПМ В–10436 на среде Эшби со следующим составом, в г/л: NaCl 0,2; K₂HPO₄ 0,1; MgSO₄ 0,2; K₂SO₄ 0,1; CaCO₃ 5; с концентрацией сахарозы 50, 60, 70 г/л в течение 3 сут. при температуре 30°С и скорости вращения перемешивающего устройства 250 об/мин в аэробных условиях с последующим отделением культуральной жидкости центрифугированием при 7000 об/мин в течение 45 мин, при этом полученный полисахарид осаждают из супернатанта абсолютированным изопропиловым спиртом в соотношении 2:1, после чего лиофилизируют.