Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент протективных моноклональных антител к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к медицинской вирусологии, и касается получения моноклональных антител ;к вирусу Восточного энцефаломиелита лош эдей (ВсЭЛ), которые могут быть использованы для лечения и профилактики в медицине и ветеринарии.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, секретирующих МКА, способных эффектно защищать чувствительных животных при введении летальных доз вируса ВсЭЛ, что делает препараты данных антител перспективными в качестве средств профилактики и лечения тяжелого вирусного заболевания.

Это достигается слиянием клеток мышиной миеломы P3NS1/1-Ag4.1 с клетками селеЬенки мышей BALB/c, иммунизированных Очищенным вирусом ВсЭЛ.

Штамм получают следующим образом.

Для иммунизации используют самок мышей BALB/c. Схема иммунизации включает внутрибрюшинное введение препарата вируса ВсЭЛ трехкратно в дозе 50 мкг на мышь с интервалом в 2 недели с полным адьювантом Фрейнда. За 3 суток до слияния животным вводят 50 мкг вируса внутривенно в физрастворе. Мышей забивают с помощью хлороформа и в стерильных условиях извлекают селезенки, из которых готовят клеточную суспензию.

В качестве партнера для слияния используют 400 млн селезеночных клеток и 80 мл клеток NS1. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,5 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 2000,

XI

о

00

со X ю

Смесь центрифугируют 4 мин при 600 д. Через 8 мин слой ПЭГ медленно разбавляют раствором Версена, после чего осадок ресуспендируют и центрифугируют. Клетки распределяют в 10 культуральных микроплат. Селекция гибридных клеток проводят в среде HAT, состоящей из питательной среды ДМЕМ (М), в которую добавлены 20% фетальной сыворотки коров, 0,1 мМ гипо- ксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ ами- ноптерина..

Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа, используя в качестве антигена 200 нг очищенного вируса ВсЭЛ. Гибридому 1В2 дважды клонируют методом предельных разведении, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте.

Штамм гибридных клеток депонирован в коллекции Института цитологии АН СССР.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой NS1. Овальное ядро расположено эксцентрично и занимает значительную часть цитоплазмы.

Культуральные свойства. Среда для культивирования - среда ДМЕМ (производство ВНИИ МБ), содержащая увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиеврй кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 20 мМ HEPES (ДМЕМ (М)}. Содержание фетальной сыворотки в ростовой среде 15%. В среду также добавляют 1 мкг/мл сульфата гента- мицина. Гибридома 1В2 растет в видемоно- слойно -суспензионной культуры. Посевная доза 100-200 тыс. клеток в миллилитре, кратность рассева -1:3-1:4.

Культивирование гибридомы в организме животного. Самок мышей BALB/c сенсибилизируют внутрибрюшйнным введением 0,5 мл пристана. Через 2-4 недели животным вводят 5 млн гибридных клеток. Через 10-12 дней формируется асцитная опухоль. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитической жидкости. Гибридома прививается в 100% случаев.

Характеристика полезного продукта. МКА относятся к субклассу fgG2a. Они специфически взаимодействуют с тли-- копротеином Е2 вируса ВсЭЛ в реакции иммуноблотинга. Активность МКА в реакции нейтрализации вируса ВсЭЛ на культуре клеток Vero составляет 1:200. МКА 1В2 эффективно защищают мышей от введения летальной дозы вируса ВсЭЛ. Индекс раз- истентности составляет 6,5 Ig. Титр МКА в

ИФА составляет 1:5000 для культуральной жидкости и 1:300000 для асцита. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 30 пассажей in vitro..

Криоконсервирование. Среда для замораживания - среда ДМЕМ(М) - 50%, феталь- ная сыворотка - 40%. диметилсульфоксид - 10%, 0,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопррбирки и помещают в

0 пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота. Через сутки пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 41°

5 С. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 600 д. Осадок ресуспендируют в ростовой среде в концентрации 200-300 тыс. клеток в миллилитре и переносят в культуральные флаконы. Жизнеспо0 собность после размораживания составляет 60-80% (окраска 0.25% трипановым синим). Изобретение иллюстрируется чертежом. .

Иммуноблотинг очищенного в градиен5 те плотности сахарозы вируса ВсЭЛ. После электропереноса вирусных белков полоски нитроцеллюлозы обрабатывали 0,5%-ным раствором казеина. После насыщения мест неспецифического связывания, поло0 ски инкубировали в 2 мл культуральной среды соответствующей гибридомы. Места связывания МКА определяли при помощи меченых пероксидазой антител против им- муноглобулинов мыши. 1 - культуральная

5 среда гибридомы 1В2; 2, 3 - отрицательные контроли с нормальной мышиной сывороткой, культуральной средой мышиной миело- . мы NS1, 4 -смесь трех видов МКА к белкам Е1. Е2иСвируса ВсЭЛ (9F2, 10G8, 1В11).

0 П р и м-е р 1. Определение вирусного

белка, специфически реагирующего с МКА,

синтезируемыми тибридомой 1В2,

. Вирусный белок-мишень для МКА 1В2

определяют методом иммуноблотинга. Бел5 ки вируса ВсЭЛ, разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле переносят на нитроцеллюлозную мембрану (Mllltpore, США) по методу Roehrig et а. Перенос проводят в течение 1,5 часов на аппарате

0 Transphor (KLB, Швеция) при напряжении 80 в 0,025 М тр,ис-НС буфере, содержащем 0,192 М. глицина (рН 8,3) и 20% этанола. Контроль переноса белков на нитроцеллю-. лозе осуществляют прокрашиванием поло-5 ски мембраны амидочерным 10В. Остальные полоски помещают в 10 мМ трис- HCI буфер рН 7,2, содержащий 0,145м NaCI, 0,05% твин 20 (ТВЗ-твин) и 0,5% казеина на ночь при 4° С; Обработанные таким образом полоски инкубируют в течение часа при 37°

С с препаратами асцитическрй жидкости МКА в разведении 1:100. От избытка антител избавляются трехкратным промыванием мембран ТВС-твин. Далее мембраны обрабатывают кроличьей анти- сывороткой к мышиным IgG, меченой перок- сидазой в разведении 1:200. Выдерживают 2 часа при комнатной температуре. Полоски промывают й проявляют в растворе хромогена, содержащем 1 мг/мл 4-хлор-1-нафто- ла и 0,03% перекиси водорода в 50 мМ трис-HCI буфере рН 7.4 и 0.145 MNaCI. Взаимодействие МКА с вирусными белкам проявляются в виде ярких сине-фиолетовых Полос. По данным иммуноблотинга МКА 1В2 взаимодействуют гликопротеиномЕ2 (55 кД) вируса ВсЭЛ (см. чертеж).

При мер 2 Определение протективной активности МКА 1В2 от летальной инфекции ВсЭЛ при пассивном введении.

Для определения протективной активности МКА 1В2 использовали две группы еспородных белых мышей весом 8-10 г. Одной группе животных внутрибрюшинно вводили 0,1 мл асцитическрй жидкости, со- держащей МКА 1В2, другой, используемой в качестве контрольной, вводили асцитиче- Скую жидкость, содержащую МКА гибридо- Мы 7В6 (прототип), не обладающие протёктивным эффектом. Через сутки после введения МКА животных подкожно инфицировали различными дозами вируса ВсЭЛ с ТО-кратным шагом разведении. Наблюдение за животными проводили в течение 10 дней. Протективную активность МКА выражали через индекс резистентности, который представляет собой разность.логарифмов титров вируса, определенных на животных, пассивно иммунизированных исследуемыми и контрольными МКА. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера. Результаты эксперимента представлены в таблице.

Таким образом, полученный на основе мышиной миеломы штамм гибридных клеток 1В2 продуцирует протективные МКА, которые могут использоваться в качестве средств профилактики и лечения. Данные МКА в дозе 1-2 мг защищают белых мышей от- более чем 3 млн LD.so вируса ВсЭЛ. Данные МКА относятся к lgG2a субклассу.

Вышеприведенные свойства штамма гибридных клеток 1В2 позволяют заключить, что впервые получена гибридома, синтезирующая протективные МКА к вирусу ВсЭЛ.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L BCKK (II) № 479 - продуцент протективных монокло- нальных антител к вирусу восточного энце- фаломиелита лошадей..

. Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: штамм гибридных перевиваемых клеток был получен слиянием клеток мышиной миеломы P3NS1/1-Ag4.1 с клетками сйнгенных мышей BALB/c, иммунизированных очищенным препаратом вируса, южный вариант. Гибридома секретирует моноклональные антитела lgG2, специфически взаимодействующие с гликопротеином Е2 вируса ВсЭЛ, нейтрализующие инфекционность вируса на кул ьте клеток Vero с титром 1:200 и защищающие чувствительных животных от лета- тельных доз вируса при пассивном введении. Штамм обозначен 1В2 и хранится под номером (И) 479Д, Титр антител достигает 1:5000 в культуральной жидкости и 1:300000 в асцитной. 1 табл., 1 ил. ел с

Протективная активность МКА 1 В2 от летальной инфекции вирусов ВсЭЛ при пассивной иммунизации белых мышей.

234