ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. 9E2, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ E ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА ШТАММ WNV/LEIV-VIG99-27889 Российский патент 2005 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9E2) - продуцента моноклональных антител к белку Е вируса Западного Нила (ВЗН), которые могут найти применение в медицине, иммунологии и биотехнологии с целью идентификации ВЗН, а также для стандартизации содержания белка Е в иммунодиагностикумах.

Известны зарубежные коллекции мышиных моноклональных антител (МКА) к вирусу Западного Нила, продуцируемые штаммами гибридных клеток животных [2-7]. Однако аналоги штаммов гибридных клеток животного Mus musculus - продуцентов моноклональных антител к штаммам вируса Западного Нила, циркулирующим на территории России, неизвестны.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9E2), секретирующих МКА к белку Е вируса Западного Нила, (штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889), выделенного в Волгоградской области в 1999 году от больного [1]. Продуцируемые МКА можно эффективно использовать для выявления штамма WNV/LEIV-Vlg99-27889 ВЗН, который вызывает заболевания человека на территории России.

Указанный технический результат достигается путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS0/1) миеломы с клетками селезенки мыши BALB/c, иммунизированной инактивированным препаратом ВЗН (штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889), который был получен в результате культивирования и очистки вируса [1].

Заявляемый штамм гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9E2) получен в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") Минздрава Российской Федерации и депонирован в Коллекции клеточных культур НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" под номером №НИИМБ-280. Авторское название гибридомной клеточной линии - 9Е2.

Штамм Mus musculus L. НИИМБ - 280 (9Е2) характеризуется следующими признаками:

Родословная штамма. Штамм гибридных культивируемых клеток получен путем слияния клеток мышиной миеломы p3-X63/Ag8.653 (NS0/1) с клетками селезенки BALB/c мышей, иммунизированных очищенным инактивированным препаратом вируса Западного Нила. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленгликоля фирмы Sigma с молекулярным весом 1000. Штамм выращивали на селективной среде ГАТ, затем трижды клонировали методом предельных разведений, используя в качестве клеток-кормилок перитонеальные макрофаги мышей BALB/c. Выход позитивных клонов в последнем клонировании составил 100%.

Число пассажей к моменту депонирования - 7-10 пассажей

Маркерные признаки и методы их оценки. Штамм секретирует мышиные иммуноглобулины, специфически взаимодействующие с белком Е ВЗН. Анализ мышиных иммуноглобулинов проводят методом иммуноферментного анализа, используя в качестве антигена 200 нг очищенного и инактивированного вируса Западного Нила, и антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена.

Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.

Морфологические признаки. Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой NS0/1.

Культуральные свойства. Среда для культивирования - среда Игла MEM в модификации Дульбекко, содержащая увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до,12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 20 мМ HEPES. Содержание фетальной сыворотки в ростовой среде - 10%. В среду также добавляют, 80-160 мкг/мл сульфата гентамицина.

Штамм является монослойно-суспензионной культурой, в которой до 20% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности посуды для культивирования. Клетки с поверхности культуральной посуды удаляются раствором трипсина:версена=1:1 (объем/объем). Посевная доза 200 тысяч кл/мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Индекс пролиферации - не менее 5.

Культивирование гибридомы в организме животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") предварительно вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана (Sigma). Через 2-4 недели животным прививают внутрибрюшинно 10 млн гибридных клеток. Асцитическая опухоль формируется на 7-10 день. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитической жидкости, содержащей МКА. Гибридома прививается в 100% случаев.

Характеристика полезного продукта. Типирование гибридомных иммуноглобулинов проведено методом иммунодиффузии по Оухтерлони. МКА относятся к субклассу IgG2A. Они специфически взаимодействуют с белком Е ВЗН (53-54 kD) в реакции иммуноблота. Титр МКА в асците составляет не менее 1:2187000 в ИФА. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro. Из одного миллилитра асцитической жидкости можно получить 3-5 мг очищенных моноклональных антител. Штамм стабильно продуцирует МКА на протяжении одного месяца непрерывного перевивания в культуре.

Криоконсервирование. Среда для замораживания - среда ДМЕМ(М) - 50%, фетальная сыворотка - 40%, диметилсульфоксид - 10%. 1-1,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,0 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота и через 18-24 часа пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и клетки переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч в миллилитре. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-80% (по результатам окрашивания 0,25% трипановым синим). Каждая ампула содержит не менее 1,0 млн/мл клеток.

Изобретение поясняется графическим материалом, представленным на фиг.1 и раскрывающим связывание в иммуноблоте моноклональных антител, продуцируемых штаммом Mus musculus L. НИИМБ - 280 (9Е2), с белком Е вируса Западного Нила, (штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889).

Методика получения заявляемого штамма

Штамм гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ - 280 (9Е2) получают следующим образом. Самок мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор"), массой 15-20 г, иммунизируют по схеме, которая приведена ниже в таблице.

Таблица
Схема иммунизацииДниРаствор для разведения антигенаДоза антигена (мкг/мышь)Область инъекции0Полный адьювант Фрейнда17,5Внутрибрюшинно7Неполный адьювант Фрейнда17,5Внутрибрюшинно19Неполный адьювант Фреййда17,5Внутрибрюшинно23Физиологический раствор17,5Внутривенно27Физиологический раствор17,5Внутривенно30Гибридизация(Забор селезенки) 

Для слияния используют 150 млн селезеночных клеток мышей и 150 млн клеток мышиной миеломы NS0/1. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,4 мл 45% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1000. Смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. После 3 мин паузы слой ПЭГ медленно разбавляют 5 мл раствора версена, после чего осадок ресуспендируют. Затем клетки снова осаждают (10 мин при 1000 об/мин) и осадок растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют в пять 96-луночных микроплат (Costar) по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ(М), в которую добавлены 10% фетальной сыворотки коров (Gipco), 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.

Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки микроплат (ВНИИМедПолимер) в качестве антигена сорбируют 100-200 нг очищенного ВЗН. Места неспецифического связывания насыщают 0,5% раствором казеина (ICN). Затем в лунки переносят по 100 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют 45 мин при 37°С. После инкубации лунки промывают 3-5 раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% твин-26 (Sigma). Далее в планшеты вносят по 100 мкл антивидового коньюгата (иммуноглобулины кролика против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена) и выдерживают 45 мин при 37°С. Планшеты промывают и проводят ферментативную реакцию. Результаты анализа определяют на спектрофотометре MULTISCAN при длине волны 492 нм. Полученный гибридный штамм Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2) дважды клонируют методом предельных разведении, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте. Приведенные ниже примеры подробно раскрывают полезные свойства объекта изобретения.

Пример 1. Культивирование штамма Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2), секретирующего моноклональные антитела к белку Е вируса Западного Нила в организме животных, мышей BALB/c.

Вариант 1. Мышам BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор"), весом 20-22 г, не менее чем за 10 дней до прививки гибридомных клеток вводят внутрибрюшинно по 0,3-0,5 мл пристана. Культивируемые клетки штамма, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3. Надосадок удаляют, а осадок клеток суспензируют в стерильном растворе Эрла или Хенкса. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") весом 20-22 г. внутрибрюшинно вводят каждой по 1 мл клеточной суспензии, содержащей не менее 10 млн гибридомных клеток. Через 7-10 дней животных усыпляют и из брюшной полости извлекают 3-5 мл асцитической жидкости. Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и используют для дальнейшего перевивания гибридомы, а в надосадочной жидкости определяют титр антител с помощью иммуноферментного анализа, как описано выше.

Пример 2. Выделение очищенных моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2).

Вариант №1. Асцитическую жидкость или культуральную среду, содержащие МКА, центрифугируют 20 мин при 5000 g и осадок удаляют. К выбранному объему асцитической жидкости или культуральной среды добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Полученную суспензию после инкубирования в течение ночи (18 часов) при +4°С центрифугируют 20 мин при 5000 g. Осадок, содержащий обогащенную фракцию иммуноглобулинов, растворяют в 0,01 М растворе фосфатного буфера, при рН 7,2. Остаток сульфата аммония удаляют путем гельфильтрации. С этой целью используется колонка 3×30 см, заполненная сефадексом G-25 и уравновешенная 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2.

Вариант №2. Один объем асцитической жидкости, содержащей МКА, разводят 4 объемами 0,6 М ацетатного буфера (0,04 М лимонной кислоты, 0,2 М натрия ацетата), рН 4,0 и доводят рН до 4,5 с помощью 0,1 N раствора едкого натра. К разведенному образцу добавляют по каплям, с постоянным перемешиванием, каприловую кислоту из расчета 25 мкл на 1 мл раствора и инкубируют ночь при +4°С. Затем центрифугируют 30 мин при 8000 g и осадок удаляют, а надосадок смешивают с 10-кратным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и устанавливают рН 7,4 раствором 1,0 N едкого натра. Равный объем насыщенного раствора сульфата аммония добавляют (V:V) к этому раствору, встряхивают и выдерживают ночь при +4°С или 30 мин при +20-25°С. Центрифугируют 15 мин при 5000 g. Надосадок сливают, а осадок растворяют в ФСБ, рН 7,4. Остатки сульфата аммония удаляют путем диализа против 50-100 объемов ФСБ, рН 7,4.

Пример 3. Определение методом ИФА специфического взаимодействия МКА, продуцируемых штаммом Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2), с вирусом Западного Нила.

ИФА проводился на полистироловых планшетах; антиген (очищенный и инактивированный вирус Западного Нила, штамм WNV7LEIV-Vlg99-27889) сорбировали в ФСБ, рН 7,4 в объеме 100 мкл/лунку на планшеты. Места неспецифического связывания насыщали при 37°С 45 минут 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0.145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0,1% Tween-20 (Serva), pH-7,4) и затем инкубировали с моноклональными антителами 45 минут при 37°С. Специфическое связывание МКА с антигеном выявляли антивидовыми меченными пероксидазой антителами против IgG мыши. Далее добавляли хромоген, 0,1% O-фенилендиамин, в цитратно-фосфатном буфере (0,2 М лимонной кислоты, 0,5 М Na₂HPO₃, рН 5,0) с 0,03% перекиси водорода). Останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1 N HCl и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Multiscan" (Финляндия) с использованием светофильтра с максимумом пропускания 492 нм. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали, соответственно, гомологичные неиммунную (нормальную) и гипериммунную сыворотки.

Пример 4. Выявление в иммуноблоте взаимодействия МКА, продуцируемых штаммом Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2), с белком Е ВЗН штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889.

Вирусные белки после 12% ПААГ-электрофореза были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США). Места неспецифического связывания насыщали 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0,145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva), pH-7,4) при 37°С 2 часа. Затем отдельные полоски мембраны инкубировали с моноклональными антителами 4 часа при 20-22°С. Специфическое связывание антител, взаимодействующих с вирусными белками, выявляли с помощью конъюгата антивидовых антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена.

В качестве отрицательного контроля использовали NS/0-асцитическую жидкость в разведении 1/500, в качестве положительного контроля - антисыворотку к ВЗН в разведении 1/500 от мышей, используемых для получения гибридом. Результаты представлены на чертеже.

Вышеприведенные свойства штамма гибридных клеток НИИМБ-280 (авторское название клеточной линии 9Е2) позволяют заключить, что впервые на основе мышиной миеломы получена гибридома Mus museums L. НИИМБ - 280 (9Е2) - продуцент МКА к белку Е вируса Западного Нила, штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889. Штамм гибридных клеток обеспечивает получение мышиных иммуноглобулинов класса IgG2a в количестве 3-5 мг очищенных антител из миллилитра асцитической жидкости. Очищенные МКА специфично реагировали в ИФА с вирусом Западного Нила (титр МКА составлял не менее 1:2187000) и выявляли в иммуноблоте белок Е ВЗН, штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889. Указанный вирус был выделен в Волгоградской области в 1999 году от больного [1], что позволяет эффективно использовать продуцируемые штаммом МКА для выявления случаев лихорадки вируса Западного Нила на территории России.

Вышеуказанные свойства штамма Mus museums L. НИИМБ-280 (9Е2) отличают его от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к белкам вируса Западного Нила.

Источники информации

1. А.Г.Прилипов, Е.И.Самохвалов, Д.К.Львов, В.Л.Громашевский, А.М.Бутенко, О.И.Вышемирский, В.Ф.Ларичев, С.Я.Гайдамович, Н.В.Хуторецкая, А.Г.Воронина, Д.В.Новиков, В.В.Мохонов, С.В.Альховский. Генетический анализ вирусов лихорадки Западного Нила, выделенных на юге Русской равнины (Волгоградская и Астраханская области) в 1999 г. Вопросы вирусологии 2001, 46(1): 8-12.

2. Blitvich B.J., Marienee N.L., Hall R.A., Calisher C.H., Bowen R.A., Roehrig J.T., Komar N., Langevin S.A., Beaty B.J. Epitope-blocking enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of serum antibodies to west nile virus in multiple avian species. J. Clin. Microbiol. 2003, Mar; 41(3): 1041-7.

3. Beasley D.W., Barrett A.D. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. J. Virol. 2002, Dec; 76(24): 13097-100.

4. Hall R.A., Scherret J.H., Sedlak P., Poidinger, Mackenzie J.S. Isolation of homologous arbovirus cultures from heterologous mixtures using limig dilution and virus-specific enzyme immunoassays. J. of Virol. Meth. (1999), 83: 189-192.

5. Hunt A.R., Hall R.A., Kerst A.J., Nasci R.S., Savage H.M., Panella N.A., Gottfried K.L., Burkhalter K.L., Roehrig J.T. Detection of West Nile virus antigen in mosquitoes and avian tissues by a monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassay. J. Clin. Microbiol. 2002, Jun; 40(6): 2023-30.

6. Peiris J.S.M., Porterfield J.S. and Roehrig J.T. Monoclonal antibodies against the flavivirus West Nile. J. Gen. Virol. 1982; 58: 283-289.

7. Morvan J., Besselaar T., Fontenille D., Coulanges P. Antigenic variations in West Nile virus strains isolated in Madagascar since 1978. Res Virol. 1990 Nov-Dec; 141(6): 667-76.

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9E2) - продуцента моноклональных антител (МКА) к белку Е вируса Западного Нила (ВЗН). Вирус Западного Нила (штамм WNV/LEIV-VIg99-27889) выделен в Волгоградской области в 1999 году от больного. Продуцируемые МКА можно эффективно использовать для выявления штамма WNV/LEIV-VIg99-27889 ВЗН, который вызывает заболевания человека на территории России. Новый гибридный штамм клеток получен путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS0/1) миеломы с клетками селезенки мыши BALB/c, иммунизированной очищенным и инактивированным препаратом ВЗН (штамм WNV/LEIV-VIg99-27889). Штамм гибридных клеток Mus musculus L. НИИМБ-280 (9E2) депонирован в Коллекции клеточных культур НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" под номером №НИИМБ - 280. Авторское название гибридомной клеточной линии - 9E2. Использование гибридомы позволяет получать специфические моноклональные антитела к белку Е вируса Западного Нила, что в свою очередь дает возможность идентифицировать ВЗН, а также стандартизировать содержание белка Е в иммунодиагностикумах. 1 ил., 1 табл.

Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 9E2, НИИМБ-280, депонированный в Коллекции клеточных культур НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор", используемый для получения моноклональных антител к белку Е вируса Западного Нила штамм WNV7LEIV-VIg99-27889.