Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии, конкретно к способам анализа биополимеров, и может быть использовано для аналитических и диагностических целей, когда белки и гликопроте- иды анализируются с помощью антител, лектинов, иммуноферментных методов и т.д.
Целью изобретения является упрощение и ускорение способа за счет сокращения стадий.
Цель достигается тем, что в способе подготовки, включающем разделение смеси биополимеров путем изоэлектрического фокусирования на ультратонком ПААГ с полимерной подложкой с последующим переносом разделенных биополимеров электроблоттингом на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) и их анализом с помощью высокомолекулярных зондов, отличием является то, что в качестве полимерной подложки используют целлофан. Целлофан - листовой материал, получаемый из регенерированной целлюлозы, толщиной около 0,02 мм. В способе используют влагопрони- цаемый целлофан (бывает еще влагонепроницаемый, покрытый нитроцеллюлозным лаком).
Электроблоттинг в этом случае проводят с геля, сцепленного с подложкой. При этом на гель накладывают НЦМ и по 2 кусочка предварительно вымоченного в 0,7% УК ватмана (фильтровальной бумаги) и помещают такой сэндвич в аппарат для элект- роблоттинга.
Указанные отличия позволяют не проводить операцию пресс-блоттинга, необходимую в прототипе, а операция снятия нитроцеллюлозной мембраны с геля после электроблоттинга упрощается и занимает всего 2-3 мин (вместо 30 мин в прототипе)
Способ осуществляют следующим образом
Готовят ПААГ нужного состава и размеров. Для этого к стеклянной пластинке нужW
fe
о
00
ГО
о ел
ного размера притирают вымоченный в воде целлофан, заливают деаэрированный раствор мономеров акриламида и бисакрм- ламида с добавками, необходимыми для полимеризации и последующего разделения белков, накладывают формообразующую пластинку, зажимают прищепками и оставляют до полной полимеризации (примерно 1 ч).
После полимеризации переносят гель на охлажденный столик прибора для изо- злектрического фокусирования, накладывают электродные полоски, вымоченные в анолите и католите, и проводят предфокуси- ровку 10-20 мин. Затем наносят в щели аппликатора, наложенного на гель,2-4 мкл белковой смеси (3-10 мкг/мкл) и проводят изозлектрическое фокусирование белков 30-60 мин при 400 В, а затем удаляют остатки белковой смеси и фокусируют 1-1,5 ч при 1500-2000 В. Сразу после фокусировки собирают сэндвич, состоящий из 2-3 кусочковфильтровальнойбумаги, предварительно вымоченной в 0,7% УК, геля с подложкой, НЦМ и сверху 2-3 кусочка фильтровальной бумаги. Важно, чтобы между гелем и НЦМ не оставалось пузырьков воздуха. Всю стопку помещают в прибор для блоттинга с учетом полярности так, чтобы белки двигались из геля к мембране. Электроблоттинг проводят при напряженности поля 10 В/см 10-150 мин, в зависимости от молекулярной массы переносимых белков. В способе используют целлофан фирмы ЛКБ (Швеция) или мембрану гидрат- целлюлозную для гемодиализа (ТУ 6-06-475- 80), целлофан ТУ 6-06-439-78.
Пример. Готовят гель в соответствии с указанным описанием и проводят изо- электрическое фокусирование (ИЭФ) мембранных белков и гликопротеидов, выделенных из легких. Гель с разделенными белками и гликопротеидами снимают с аппарата для ИЭФ и накладывают на него НЦМ, предварительно вымоченную в 0,7% УК. Сверху накладывают 2 куска ватмана ЗММ, переворачивают полученный сэндвич и со стороны подложки также накладывают 2 кусочка ватмана. Этот ансамбль помещают в держатель аппарата для электроблоттинга (НЦМ) со стороны катода
(-) и проводят перенос в течение 2 ч при 103С.
После электроблоттинга анализируют гликопротеиды на НЦМ с помощью лектина Соп-А, выявляя углеводную специфичность
этих гликопротеидов.
В таблице приведена характеристика способа в сравнении с прототипом.
Использование предложенного способа позволяет ускорить известный способ и
упростить его, так как нет необходимости снимать гель с подложки и с особой осторожностью снимать НЦМ с геля, так как не требуется пресс-блоттинг и НЦМ не прилипает к гелю. Увеличивает воспроизводимость и надежность метода, так как исключается повреждение геля в процессе удаления подложки. Увеличивается точность метода, так как исключается сдвиг полос разделенных белков и гликопротеидов
относительно друг друга вследствие изменения размеров геля, который может набухать или сниматься, не будучи прикрепленным к подложке..
Формула изобретения
Способ подготовки смеси белков и гликопротеидов к анализу с помощью молекулярных зондов, включающий проведение изоэлектрофоретического фокусирования смеси в ультрзтонком полиакриламидном
геле, закрепленном на полимерной подложке, электрофоретического переноса разделенных компонентов на твердую матрицу с последующим анализом на ней компонентов с помощью молекулярных зондов, о т яичзющийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа за счет сокращеня стадий, в качестве подложки используют целлофан, а электрофоретический перенос осуществляют с системы, состоящей из геля, закрепленного на целлофановой подложке, на нитроцеллюлозную мембрану, помещенную на поверхность геля.
Основные этапы способа
Время, необходимое на каждом этапе
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для подготовки смеси белков и гликопротеидов к анализу с помощью молекулярных зондов. С целью упрощения и ускорения способа, включающего изоэлектрическое фокусирование на ультратонком полиакриламидном геле, закрепленном на полимерной подложке, и злектрофоретический перенос, в качестве подложки используют целлофан, электрофоретический перенос осуществляют с ансамбля, состоящего из ультратонкого геля с целлофановой подложкой и нитроцел- люлозной мембраны, наложенной на поверхность геля.1 табл.
Подготовительная работа и разделение белков и гликоп- ротеидов
Пресс-блоттинг с предварительным вымачиванием геля Электрофоретический перенос (электроблоттинг) Снятие НМЦ с геля Анализ белков и гликопроте- идов на мембране
4ч
0,5ч 0,5ч
до 2 ч 0,5ч
4ч
0,5ч
О
до 2 ч 2-3 м
Зависит от задачи и выбранной методики
Итого:
прототип
предложенное
4ч
0,5ч
О
до 2 ч 2-3 мин
до 7.5 ч
до б ч
| Electrophoresls, 1987, № 8, р | |||
| Способ закалки пил | 1915 |
|
SU140A1 |
