Способ определения изопероксидаз-антигенов Советский патент 1990 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к физико-химической биологии,.а именно к биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, и может быть использовано при изучении пероксидаз, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека.

Целью изобретения является упрощение способа за счет исключения стадии радиоиммунологического анализа.

Цель достигается тем, что для выявления изопероксидаз-антигенов на полиакриламидный гель (можно использовать и агарозный) накладывается и прижимается нитроцеллюлозная мембрана, на которой предварительно сорбированы антитела. После определенного вре- времени их разделяют и обрабатывают (и гель, и мембрану) реактивами на пероксидазную активность. На геле проявляются вес имеющиеся изоформы пер- оксидазы, а на нитроцеллюлозной мембране - лишь те, которые являются антигенами и связывались антителами, сорбированными на нитроцеллюлозной мембране.

Способ осуществляется следующим образом.

Листья семидневных проростков кукурузы измельчают в трис-глициновом буфере рН 8,3, содержащем 30% сахарозы в соотношении растительный материал: буфер 1:5. После центрифугирования надосадочную жидкость диали- зуют против дистиллированной воды и осаждают белки ацетоном Полученный осадок белков растворяют р 30%-ном растворе сахарозы и испольчуют для изоэлектрофокусирования0 Нпоэлектро- фокусирование (НЭФ) проводят в 5%- ном полиакриламидном г.те, содержа« J

tei5№i

щем 2% амфолинов с интервалом рН 3,5- 10,0. Размер пластины геля 110 х xlpOxl мм. Режим ИЭФ 5 мин - 130 В, 30 мин - 200 В{ 60 мин - 750 В.

После окончания ИЭФ на пластину геля накладывают нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,22 мкм с сорбированными антителами (мембрану предварительно инкубируют с антисывороткой при комнатной температуре при постоянном покачивании в течение одного ча- п-). :.:. ч.у мембраны накладывают 4-5 листов фильтровальной бумаги, пропитанной 0,01 М Na-фосфатным буфером рН 7,/, содержащим 0„85%-ную NaCl, накрьшают стеклом и прижимают грузом массой 500. г.

Процесс конъюгации антигенов с антителами идет один час при комнатной температуре. Затем гель и нитроцеллю. лозную мембрану разъединяют, гель и мембрану опускают в 0,02%-ный раствор солянокислого бензидина и выдерживают 30 и 5 мин соответственно, после чего гель и мембрану заливают раствором перекиси водорода. После того, как ппчвятс лэяосы белков., обладающих пероксидазной активностью, сравнивают местонахождение их на нитроцеллю-

лозной мембране и полиакриламидном геле и идентифицируют изопероксидаз- антигены.

Таким образом, упрощение предлагаемого способа достигается за счет сокращения количества операций кроме того, для его реализации не требуются меченые вторые антитела или белок А.

Формула изобретения

Способ определения изопероксидаэ- антигенов, включающий электрофорети- ческое разделение изопероксидаз в геле, перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану, определение пероксидазной активности в геле и регистрацию антигенов с помощью антител на мембране отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет исключения стадии радиоиммунологичес-1 кого анализа, перед переносом белка нитроцеллюлозную мембрану предварительно обрабатывают специфической антисывороткой к антигену, а регистрацию антигена, перенесенного на мембрану, осуществляют по пероксидазной активности,

Изобретение относится к физико-химической биологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, и может быть использовано при изучении пероксидаз, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека. Целью изобретения является упрощение способа определения изопероксидаз-антигенов. Изобретение состоит в том, что при определении изопероксидаз-антигенов перед переносом разделенного белка с геля на нитроцеллюлозную мембрану ее предварительно обрабатывают специфической антисывороткой к антигену, а регистрацию антигена, перенесенного на мембрану, осуществляют, определяя пероксидазную активность.