Способ идентификации лектинов Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/40 A01H1/04 G01N33/00 

Ё

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биохимии растений, и может быть использовано в биохимии иммунитета растений и патогенам и в медицинской биохимии для идентификации компонентов лектинов в спектрах белков. Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности анализа. Для этого перед фракционированием подбирают оптимальный состав реплики, на поверхности которой могут иммобилизоваться лектины, и после фракционирования на разделяющий гель накладывают реплику, с которой лектины связываются, после чего реплику погружают в раствор эритроцитов и по ярко-красным полосам идентифицируют лектины.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биохимии растений и животных, и может быть использовано в области биохимии иммунитета растений к патогенам и в медицинской биохимии для идентификации компонентов лектинов в спектрах белков после электрофореза, изо- электрического фокусирования или фракционирования белков другими методами.

Лектины - это белки, специфично связывающиеся с определенными углеводными группами, которые могут входить в состав гликопротеинов слюны или крови животных, яичного белка и т.д. Важную биологическую роль играют углеводные остатки, находящиеся на поверхности клеток - эритроцитов, спор патогенных грибов и т.д. Лек- тины благодаря своим свойствам участвуют в реакциях узнавания в морфогенезе и в защитных реакциях животных и растений.

Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности анализа.

Способ состоит в том, что перед фракционированием неочищенных белков предварительно устанавливают состав реплики, оптимальный для связывания определяемых лектинов, а после фракционирования белки из разделяющего геля переносят на реплику, с которой лектины связываются, затем реплику погружают в суспензию эритроцитов и идентифицируют лектины на реплике по ярко-красным полосам, образованным эритроцитами.

Суть метода заключается в следующем. Лектины связываются с репликой либо за счет специфичного взаимодействия с включенными в состав реплики гликопротеинами, или углеводами, остатки которых соответствуют специфичности лектинов, либо за счет неспецифичного взаимодействия с материсл.

о

ч

о

злами реплики, например с нитроцеллюлозой. Молекулы лектинов, фиксированные на поверхности реплики, способны соединяться с углеводными остатками мембран эритроцитов своими свободными реакционными центрами. Фиксация лектинов на реплике позволяет им достаточно прочно удерживать эритроциты, что, например, дает возможность даже прополаскивать реплику в физиологическом растворе для уменьшения фона от неспецифичности осевших эритроцитов. При отсутствии такой фиксации механически стабильных спектров агглютинировавших эритроцитов получить практически невозможно или по крайней мере очень трудно.

П р и м е р 1. Идентификация компонентов агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) в спектрах белков зародышей после изофо- кусирования.

Зародыши отделяют от зерна пшеницы сорта Безостая 1. Навеску из 100 мг зародышей, размолотых в ступке, заливают 1 мл 0,1 HCI. Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают.

Для выбора оптимального для определяемого лектина состава реплики готовят несколько типов реплик: ПААГ, обработанный мукопротеинами слюны; ПААГ, обрабо- танный каким-либо другим типом гликопротеинов; нитроцеллюлозная мембрана, обработанная каким-либо гликопро- теином; гель(акриламидный, агарозный или другой), в состав которого включены опре- деленныеуглеводные группы; необработанная нитроцеллюлозная мембрана и т.д.

На поверхность реплики наносят каплями по 2-10 мкл изучаемый раствор белков, содержащий лектины. Через 10-20 мин реплики промывают физраствором и помещают в суспензию эритроцитов. При оптимальных для изучаемого лектина условиях осуществления способа на месте нанесения образца появляется ярко-красное пятно. В случае АЗП оптимальной является реплика, состоящая из ПААГ, содержащего мукопротеины слюны и обработанного глу- таровым альдегидом для связывания мукоп- ротеинов с ПААГ.

Проводят изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) белков в 6%-ном ПААГ толщиной 0,2 мм, содержащем 2% амфолина с интервалом рН 3-10. Образцы наносят на гель с помощью полосок фильтровальной бумаги в объеме 1-20 мкл. Полимеризуют 6%-ную ПААГ-реплику толщиной 0,2 мм на пластиковой подложке. Реплика содержит 0,9% NaCI в фосфатном буфере рН 7,5. Реплику обрабатывают в течение минуты мукопротеинами слюны человека. Затем

реплику накладывают на 40 мин на бумагу, смоченную 10%-ным Глухаревым альдегидом. Реплику ополаскивают в физрастворе 5-10 мин и слегка подсушивают для удаления капель влаги. После ИЭФ на разделяющий гель накладывают гель-реплику на 10-30 мин. Затем реплику погружают в суспензию (1-4% по обьему) эритроцитов кролика. Через 5-20 мин на поверхности

0 гель-реплики появляются четкие ярко-красные полосы, образованные эритроцитами, связанными с лектинами.

На разделяющий гель после реплики накладывают фотопленку на 20 мин и проявля5 ют ее трипсином для идентификации компонентов ингибиторов трипсина. Изо- точки лектинов и ингибиторов трипсина из зародышей пшеницы несколько отличаются.

0 Таким образом, предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет идентифицировать в спектре белков компоненты лектинов и наличие примесей белков с иной специфичностью не влияет на результаты.

5П р и м е р 2. Идентификация компонентов лектина фасоли.

Выбор оптимального варианта реплики проводят, как в примере 1. Для лектина фасоли наиболее оптимальной репликой явля0 ется необработанная нитроцеллюлозная мембрана.

Проводят ИЭФ препарата лектина фасоли. На разделяющий гель накладывают необработанную нитроцеллюлозную мемб5 рану. После переноса белков за счет диффузии (10-20 мин) мембрану погружают в суспензию эритроцитов. Компоненты лектинов фасоли проявляются в виде ярко-красных полос. В этих же условиях АЗП

0 выявляются очень слабо, т.е. чувствительность данного варианта способа достаточна для лектина фасоли и недостаточна для АЗП.

Использование предлагаемого способа

5 обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества.

Повышение достоверности и разрешающей способности анализа при идентификации компонентов лектинов. Компоненты

0 лектинов выявляются непосредственно на реплике с разделяющего геля и примесь других белков не влияет на результаты.

С одного геля можно снять несколько реплик, обработанных разными гликопроте5 инами или углеводами для идентификации разных типов лектинов; желатиновые реплики для идентификации ингибиторов про- теиназ, реплики, содержащие субстраты для идентификации различных ферменов и их ингибиторов и т.п.

Упрощение и повышение производи-упрощения и повышения разрешающей тельности анализа, сокращение его продол-способности анализа, перед фракциониро- жительности. Отпадает необходимостьванием белков предварительно подбирают очистки лектинов. На одном геле можно од-состав реплики, оптимальный для связыва- новременно анализировать 20-30 образцов5 ния определяемых лектинов, а после фрак- суммарных экстрактов белков, содержащихционирования белки из разделяющего геля лектины. Идентификацию компонентов лек-переносят на реплику, с которой лектины тинов можно провести за 20-30 мин послесвязываются, затем реплику погружают в ИЭФ. суспензию эритроцитов и идентифицируют Формулаизобретения10 лектины на реплике по ярко-красным поло- Способ идентификации лектинов, вклю-сам, образованным эритроцитами, причем чающий фракционирование белков в гелях,фракционированию подвергают неочищен- отличающийся тем, что, с цельюные белки.