Способ низкотемпературного консервирования эмбрионов Советский патент 1991 года по МПК A01N1/00 

Изобретение относится к криобиологии и может найти применение для длительного хранения репродуктивных клеток редких и исчезающих видов животных.

Целью изобретения является повышение сохранности биологических свойств эмбрионов до стадии бластоциста.

Способ осуществляется следующим образом.

Эмбрионы мышей, полученные на стадии 32 бластомеров, разбавляют 1:1 тремя последовательно добавляемыми порциями с интервалом 3 мин, смеси криопротекторов: глицерина, пропиленгликоля и диме- тилсульфоксида (ДМСО) и метилирующего агента - холина-хлорида на стандартной фосфатно-солевой среде Дюльбекко. Концентрация криопротекторов после смешивания с эмбрионами составляет 4.75 5,25%, а холина-хлорида 0,4%. Время разбавления составляет 15-20 мин и является временем эквилибрации. Все указанные процедуры осуществляют при 4-8°С. После эквилибрации эмбрионы разливают в контейнеры, изготовленные из пищевой фольги, объемом 0,1 мл, которые завальцовывают и погружают на 5-10 с в порошок цинка, охлажденной до температуры жидкого азота (-196°С), а затем переносят в жидкий азот для хранения. Размораживание осуществляют в водяной бане при 40°С в течение 5 - 10с.

П р и м е р 1. 60 эмбрионов разделяют на 6 групп по 10 эмбрионов. В каждую из групп внесли по 5 капел фосфатно-солевой среды Дюльбекко, содержащий 10,5% глицерина (чда), 10,5% пропиленгликоля (чда), 10,5% ДМСО и 0,8% холина-хлорида, при

ON 00

СО

о

N)

этом концентрация каждого из криопротек- торов составила 5,25%, а холина-хлорида 0,4%. Все процедуры проводят при температуре 4°С. Разбавленные эмбрионы переносят в контейнеры из пищевой фольги с толщиной стенок 0,03 мм и размерами 1 х1,5 см, обьемом 0,1 мл. Свободные края контейнера завальцовывают и погружают на 10 с в металлическую емкость, заполненную порошком Zn, и погруженную в жидкий азот. После этого контейнеры переносят в жидкий азот, где хранят в течение 2 недель. Размораживали в водяной бане при 40°С. После размораживания развитие в культуре составило 94,8%.

Для обоснования концентрации криоп- ротекторов проводили эксперименты аналогично примеру 1,только брали различные концентрации криопротекторов (4,75%).

Сохранность эмбрионов определяли по данным развития их в культуре до стадии

бластоцисты.

Предложенный способ позволяет повысить сохранность эмбрионов после размораживания на 27%.,

Формула изобретения

Способ низкотемпературного консервирования эмбрионов, включающий замораживание до -196°С в фосфатно-солевой среде Дюльбекко с криопротектором глицерином, отличающийся тем, что, с целью повышения сохранности биологических свойств эмбрионов до стадии бластоцисты, в среду добавляют 0,4%-й раствор холина- хлорида, пропиленгликоль и диметилсуль- Фоксид до конечной концентрации 4,75-5,25% каждый, а замораживание ведут в емкости с порошком цинка, предварительно охлажденным до -196°С.

Изобретение может найти применение для длительного хранения репродуктивных клеток редких и исчезающих видов животных. Цель - повышение сохранности биологических свойств эмбрионов до стадии бластоциста. Для достижения цели к эмбрионам мышей, полученным на стадии басто- меров, добавляют смесь криопротекторов: глицерина, пропиленгликоля, диметилсуль- фоксида и 0,4% раствор холина-хлорида, на стандартной фосфатно-солевой среде Дюльбекко до конечной концентрации 4:75- 5,5% каждый. Все процедуры осуществляют при температуре 4-8°С. После эквилибра- ции эмбрионы разливают в контейнеры, за- взльцовывают их и погружают контейнеры на 5-10 с в порошок цинка, охлажденный до температуры жидкого азота (-196°С). Затем контейнеры перекосят для хранения в жидкий азот.