СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ ГРЕБНЕВИКА BEROE OVATA Российский патент 2007 года по МПК C12N5/06 

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам криоконсервации для длительного хранения биологических клеток, и может быть использовано в рыбоводстве для биокультивирования и получения гребневиков Beroe ovata в нужные сроки. Гребневик Beroe ovata известен как стенофаг, способный подавить и регулировать численность популяции своей жертвы - гребневика Mnemiopsis leidyi A.Agassiz. Последний наносит огромный ущерб рыбному хозяйству, выедая кормовую базу ценных видов рыб-планктофагов [1].

Массовое развитие хищника Mnemiopsis leidyi A.Agassiz отмечается весной и в начале лета, между тем как массовое развитие гребневика Beroe ovata начинается со 2-й половины лета, когда ущерб биоте уже нанесен.

Отсюда вытекает задача своевременного искусственного подселения гребневика Beroe ovata в развивающуюся популяцию гребневика Mnemiopsis leidyi A.Agassiz для ее подавления, не полагаясь на естественный и запоздалый ход событий.

Содержание живой культуры гребневика Beroe ovata в искусственных условиях является высокозатратной технологией, поэтому был разработан менее затратный способ получения культуры в необходимые сроки с помощью криоконсервации оплодотворенных яиц Beroe ovata на ранних стадиях онтогенеза с последующим их оживлением.

Известен способ хранения клеток замораживанием [2], в котором первичные клетки или культивируемые клетки животных или человека в присутствии остекловываемой (витрируемой жидкости) вносят по каплям в жидкий азот.

Известен способ изготовления раствора для консервации клеток посредством замораживания [3], в котором в основной раствор добавляют глицерин и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Количество глицерина составляет примерно 10-20 об./об.%. Количество ПЭГ - около 5-10 мас./об.%.

Известные способы криоконсервации с целью длительного хранения объектов непригодны для криоконсервации гребневиков. Связано это с тем, что криоконсервация предполагает глубокое охлаждение объектов до температуры жидкого азота (-196°С). Основную проблему при замораживании объектов представляет свободная вода. Образующиеся кристаллы льда повреждают внутриклеточные и тканевые структуры объектов, поэтому при размораживании происходит декомпартментализация отдельных структур, что ведет к развитию некротических изменений и гибели объектов. Будучи самыми обводненными из водных животных, гребневики являются одними из самых сложных объектов для криоконсервации. Задача осложняется также и тем, что у гребневиков как в естественных, так и в искусственных условиях из большого числа выметаемых яиц лишь небольшая доля (обычно менее 1%) способна к дальнейшему делению и развитию.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является выбранный в качестве прототипа способ криоконсервации личинок гребневика Beroe ovata [4], в котором помещают оплодотворенные яйца (эмбрионов) гребневика в ограждающий раствор в объеме, равном 50% от объема пробы, и перемешивают. Ограждающий раствор содержит в качестве криопротекторов 40 г маннита и 300 мл глицерина в 1000 мл морской фильтрованной воды. Морская вода используется в качестве физиологической среды, поддерживающей нужную величину рН.

Затем проводят замораживание путем погружения в жидкий азот с последующим хранением в нем.

При размораживании нужный контейнер вынимают из хранилища и оттаивание проводят в ванне с водой температуры +30°С. После оттаивания размороженные яйца гребневика Beroe ovata отмывают в два этапа в отмывающем растворе, представляющем морскую фильтрованную воду с добавкой натрия (22 г хлористого натрия в 1000 мл морской фильтрованной воды).

Выход жизнеспособных яиц гребневика, полученных известным способом, составляет менее 1%.

Недостатком способа является сравнительно низкая доля выхода неповрежденных яиц гребневика, способных к дальнейшему развитию.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение выхода неповрежденных яиц гребневика, способных к дальнейшему развитию.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем помещение оплодотворенных яиц гребневика в ограждающий раствор, замораживание путем погружения в жидкий азот с последующим хранением в нем, размораживание с последующим отмыванием размороженных яиц гребневика в два этапа в отмывающем растворе и использование при этом в качестве физиологической среды для ограждающего и отмывающего растворов морской воды, согласно изобретению для криоконсервации оплодотворенные яйца гребневика выбирают на стадии 2-4 бластомеров, а морскую воду предварительно стерилизуют фильтрацией на насосе Комовского через мембранный фильтр.

Предлагаемый способ повышает сохранность яиц гребневика благодаря отбору их на оптимальной для криоконсервации стадии развития, т.е. когда соотношение объема ядра к объему цитоплазмы в клетке минимально, что облегчает "связывание" внутриклеточной жидкости криопротекторами и снижает риск повреждения субклеточных структур.

Стерилизация морской воды, используемой в ограждающем и отмывающем растворах путем фильтрации на насосе Комовского через мембранный фильтр, повышает выживаемость яиц гребневика за счет защиты их от контакта с бактериями, грибами и простейшими, способными уничтожить их в считанные часы после размораживания.

Совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение поставленной задачи.

Сравнение прототипа с заявляемым решением показало, что указанные выше признаки являются отличительными, в связи с чем заявляемый способ соответствует критерию "новизны".

Способ осуществляют следующим образом.

Суспензию индивидуально отобранных оплодотворенных яиц гребневика Beroe ovata на стадии 2-4-х бластомеров помещают в ограждающий раствор, после чего погружают в жидкий азот с последующим хранением в нем. В нужные сроки проводят размораживание, а затем отмывание размороженных яиц гребневика в два этапа в отмывающем растворе. При этом в качестве физиологической среды для ограждающего и отмывающего растворов используют морскую воду, которую предварительно стерилизуют фильтрацией на насосе Комовского через мембранный фильтр.

Пример 1.

Индивидуально отобранные оплодотворенные яйца (эмбрионы) Beroe ovata, находящиеся на разных стадиях дробления и не имеющие видимых повреждений и уродств, были разделены на группы, соответствующие стадиям дробления в 1, 2, 4, 8 и более бластомеров.

Морскую воду, использованную для приготовления сред в процессе замораживания и размораживания каждой группы яиц гребневика Beroe ovata фильтруют через обычный узкопористый бумажный фильтр типа "синяя лента".

Отобранные яйца гребневика Beroe ovata, находящиеся на стадии дробления, в 1 бластомер помещают в пластиковый контейнер с 2-3 мл морской воды. Затем добавляют ограждающий раствор в объеме, равном 50% от объема пробы, и перемешивают. Ограждающий раствор содержит 40 г маннита и 300 мл глицерина в 1000 мл морской фильтрованной воды. Контейнер закрывают крышкой, помещают в кювету и быстро замораживают, погружая в сосуд Дьюара с жидким азотом.

Оттаивание осуществляют путем переноса контейнера в ванну для размораживания температурой воды +30°С. Размороженные яйца гребневика отмывают в два этапа. На первом этапе раствор для отмывания пробы содержит 22 г хлористого натрия в 1000 мл морской фильтрованной воды. Этот раствор добавляют в размороженные яйца гребневика. Соотношение добавленного раствора к объему пробы составляет 1:1. Выдерживают 15 минут, затем добавляют раствор для второго этапа отмывания, содержащий 12 г хлористого натрия в 1000 мл морской фильтрованной воды. Соотношение добавленного объема раствора к общему объему пробы 1:1. Через 15 мин добавляют стерилизованную морскую воду в соотношении 1:1 с общим объемом воды. После 10-15-минутного выдерживания пробу с размороженными яйцами гребневика переносят в большой объем морской аэрированной воды и следят за дальнейшим развитием эмбрионов.

Результаты наблюдения за развитием размороженных яиц гребневика Beroe ovata даны в таблице 1.

Примеры 2-4

По примеру 1 осуществляли замораживание и размораживание яиц гребневика, находящихся на стадиях дробления 2, 4, 8 бластомеров и не имеющих видимых повреждений и уродств.

Результаты наблюдения за развитием размороженных яиц гребневика 1, 2, 4, 8 бластомеров даны в таблице 1.

Таблица 1№Стадия дробления яиц гребневика Beroe ovata перед
заморозкой в бластомерахНеповрежденные яйца Beroe ovata через 1 час после разморозки, %Сохранившиеся яйца Beroe ovata через 24 часа после разморозки, %Яйца Beroe ovata, продолжившие дальнейшее развитие, %11400221540,6342061481220

Из таблицы 1 видно, что при криоконсервации яиц Beroe ovata на стадии дробления в 1 бластомер после разморозки количество неповрежденных, не имеющих видимых признаков нарушения наружной оболочки яиц составило 4% от исходного. Однако все сохранившиеся яйца Beroe ovata оказались нежизнеспособными и разрушились в течение 24 часов после разморозки.

При криоконсервации яиц гребневика на стадии дробления 2 бластомера после размораживания количество неповрежденных яиц Beroe ovata, не имеющих видимых признаков нарушения наружной оболочки и бластомеров, составило 15% от исходного. Через 24 часа число сохранившихся эмбрионов составило 4% от исходного. Продолжили развитие 0,6% от исходного количества яиц.

При криоконсервации яиц гребневика Beroe ovata на стадии дробления 4 бластомера после разморозки количество неповрежденных эмбрионов Beroe ovata, не имеющих видимых признаков нарушения наружной оболочки, составило 20% от исходного. Из них 6% яиц гребневика Beroe ovata выжили через 24 часа после разморозки, а продолжили развитие 1% от исходного количества яиц.

При криоконсервации на стадии дробления 8 бластомеров после разморозки количество неповрежденных яиц гребневика Beroe ovata, не имеющих видимых признаков нарушения наружной оболочки и бластомеров, составило 12% от исходного. Через 24 часа сохранилось 2% яиц гребневика Beroe ovata. Однако ни один из сохранившихся яиц гребневика не продолжил дальнейшее развитие.

Таким образом, из таблицы 1 видно, что при криоконсервации на стадии 2-4 бластомеров число внешне неповрежденных и жизнеспособных яиц гребневика является наибольшим и лишь на этих стадиях дробления часть эмбрионов продолжает развитие после разморозки.

Это объясняется наименьшей общей обводненностью и минимальным соотношением объема ядра к объему цитоплазмы в бластомерах на данной стадии дробления, что облегчает "связывание" внутриклеточной жидкости криопротекторами и снижает риск повреждений субклеточных структур.

Примеры 5-6.

Для приготовления физиологической среды для ограждающего и отмывающего растворов использовали морскую воду, профильтрованную через обычный узкопористый бумажный фильтр типа "синяя лента". В качестве проб использовали яйца гребневика Beroe ovata на стадиях дробления в 2 и 4 бластомера, у которых выжили яйца гребневика через 24 часа после разморозки.

Замораживание и размораживание проб осуществляли описанным в примерах 1-4 способом.

Пример 7-8.

В качестве физиологической среды для ограждающего и отмывающего растворов использовали стерилизованную морскую воду, которую получали фильтрацией на насосе Комовского через мембранный фильтр.

В качестве пробы использовали яйца гребневика Beroe ovata на стадии дробления в 2 и 4 бластомера, имевших наилучшие показатели выживаемости после разморозки и продолживших дальнейшее развитие. Замораживание и размораживание проб осуществляли описанным в примерах 1-4 способом.

В таблице 2 результаты приведены для яиц гребневика Beroe ovata на стадии дробления в 2,4 бластомера, где в качестве ограждающего и отмывающего растворов использовали морскую воду, профильтрованную через обычный узкопористый бумажный фильтр типа "синяя лента", а также стерилизованную морскую воду, которую получали фильтрацией на насосе Комовского через мембранный фильтр.

Таблица 2Морская водаСтадия дробления яиц гребневика Beroe ovata перед заморозкой в бластомерахНеповрежденные яйца Beroe ovata через 1 час после разморозки, %Сохранившиеся яйца Beroe ovata через 24 часа после разморозки, %Яйца Beroe ovata, продолжившие дальнейшее развитие, %Профильтрованная21540,6Стерилизованная2371,0Профильтрованная42061,0Стерилизованная30101,5

Из таблицы 2 видно, что при стерилизации морской воды повышается доля неповрежденных жизнеспособных эмбрионов в расконсервированном материале.

Использование предлагаемого способа позволит повысить выход неповрежденных эмбрионов гребневиков Beroe ovata, способных к дальнейшему развитию.

Источники информации

1. Книга «Гребневик Mnemiopsis leidyi A.Agassiz в Азовском и Черном морях: биология и последствия вселения» под научн. ред. С.П.Воловика. - Ростов-на Дону, БКИ, 2000 - стр.432-449-ISBN 5-85796-057-6.

2. Патент Японии №3044323, МКИ С 12 N 5/06.

3. Патент Японии №3025931, МКИ С 12 N 5/06.

4. Сборник научных трудов (2000-2001 г.) «Основные проблемы рыбного хозяйства и охраны рыбоводных водоемов Азово-Черноморского бассейна». - М., 2002. Государственный Комитет РФ по рыболовству, ФГУП «АзНИИРХ», стр.238-243.

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам криоконсервации для длительного хранения биологических клеток, и может быть использовано в рыбоводстве для биокультивирования и получения гребневиков в нужные сроки. Изобретение заключается в том, что в способе криоконсервации гребневика Beroe ovata оплодотворенные яйца гребневика выбирают на стадии 2-4 бластомеров. Затем их помещают в ограждающий раствор, замораживают путем погружения в жидкий азот с последующим хранением в нем. Далее размораживают с последующим отмыванием размороженных яиц гребневика в два этапа в отмывающем растворе. При этом морскую воду, которую используют в качестве физиологической среды для ограждающего и отмывающего растворов, предварительно стерилизуют фильтрацией на насосе Комовского через мембранный фильтр. Изобретение позволяет повысить выход неповрежденных яиц гребневика, способных к дальнейшему развитию. 2 табл.

Способ криоконсервации гребневика BEROE OVATA, включающий помещение оплодотворенных яиц гребневика в ограждающий раствор, замораживание путем погружения в жидкий азот и хранение в нем, размораживание с последующим отмыванием размороженных яиц в два этапа в отмывающем растворе и использование в качестве физиологической среды для ограждающего и отмывающего растворов морской воды, отличающийся тем, что для криоконсервации выбирают оплодотворенные яйца гребневика на стадии дробления 2-4 бластомеров, а морскую воду предварительно стерилизуют фильтрацией на насосе Комовского через мембранный фильтр.