Способ получения полисахарида Советский патент 1991 года по МПК C08B37/00 

г

(Я

Изобретение относится к химии и технологии высокомолекулярных соединений, в частности к получению водорастворимого полисахарида из соцветий липы сердцевидной. Изобретение позволяет получить полисахарид, обладающий противогипоксической и антикоагулянтной активностью за счет того, что соцветия липы сердцевидной обрабатывают сначала 10%-ным водным раствором хлорис- - того аммония при модуле 20 и pll 5,8- 6,0 и затем 5%-ным раствором диэтилового эфира в этаноле при модуле 50 с последующей сушкой при 35-40°С, проводят экстракцию водой при 80°С и модуле 30, выделяют целевой продукт концентрированием экстракта и обработкой двойным объемом этилового спирта при 5°С. 9 табл.

Изобретение относится к химии и технологии высокомолекулярных соединений, в частности к получению водорастворимого полисахарида из соцветий липы сердцевидной о

Цель изобретения - получение полисахарида, обладающего противогипокси- ческой и антикоагулянтной активностью.

Пример 1. Выделение полисахарида проводят из фармакопейного растительного сырья (ГФ X, цветки липы сердцевидной).

Очистка сырья. Для удаления сопутствующих белков цветки липы сердцевидной обрабатывают 10%-ным раствором хлористого аммония (1:20) при рН 5,8- 6 в течение 6 ч. Шрот отделяют от жидкости фильтрованием. Для удаления низкомолекулярных примесей, в том числе и неорганических, шрот обрабатывают 5%-ным раствором диэтилового эфира в этаноле (1:50) и взбалтывают

2 ч. Затем отфильтровывают. Остаток повторно обрабатывают новой порцией раствора той же концентрации. Процесс очистки проводят при комнатной температуре и энергичном перемешивании. Остаток сушат при 35-40°С до воздушно-сухого сырья.

Экстракция. Очищенное сырье заливают горячей водой (1:30) при 80°С в течение 2 ч. Затем отфильтровывают через двойной слой марли. Дополнительно фильтруют через двойной слой бумаги под вакуумом. Экстракт упаривают в вакууме над РгОу (остаточное давление 10-15 мм рт.ст., температура 35-40°С) до 1/20 первоначального объема. Сгущенный экстракт охлаждают до +5 С и медленно при энергичном перемешивании прибавляют двойной объем 96%-ыого этанола, подкисленного соляной кислотой (на 1 л %Х-ного этанола 10 мл соляной кислоты). Оставляют

на ЬО мин. Затем осадок отделяют от жидкости при центрифугировании. Промывают ЬО и 96%-ным этанолом и диспергируют в ацетоне.

Выделенный полисахарид условно назван гликуроногликан.

Вькод 11,5% от веса воздушно-сухого сырья. Зольность 1,5%. Полученный продукт может быть дополнительно очи- щен от белковых примесей. 1%-ные растворы полисахарида обрабатывают смесью хлороформа и амилового спирта (в соотношении 3:1), встряхивают 25 ч. Затем центрифугируют. Водный слой повторно обрабатывают смесью амилового спирта с хлороформом. Операции по повторяют до отрицательной реакции водного слоя с 20%-ной сульфосалициловой кислотой. Раствор (водный слой) 20 из ВТ°Р°ГО животного. Гемокоагулограмму записывают через 5, 2, 24 и 48 ч после введения гликуроногликана. В качестве контроля используют изотонический раствор натрия хлорида. 25

упаривают в вакууме и выделяют полисахарид, как описано выше. Сушат в вакууме над ПРИ 35-40 С (остаточное давление 10-15 мм рт.ст.)

в течение 10 ч. Выход 95%, зольность 0,6-0,8%.

Пример 2. Биологическую активность гликуроногликана оценивают:

а) антигипоксическую активность - на трех моделях гипоксической гипоксии (табл.1,2,3);

5) антикоагулянтную активность - по данным гемокоагулограмм (табл.4);

в) острую токсичность - по тесту летальных доз (табл.5).

Препаратом сравнения служит муко- полисахарид - гепарин„ В качестве контроля используют аналогичные объемы изотонического раствора хлорида натрия.

Противогипоксическую активность гликуроногликана, вводимого внутри- брюшинно белым мышам массой 20+2 г v объемом не превышающим 1,0 мл (90 опытов), оценивают по времени сохранения биоэлектрической активности сердца (ЭКГ) и наличию дыхательных движений у животных.

Гипоксическую гипоксию моделируют при температуре окружающей среды (18-21°С) путем: а) абтурация трахеи; б) снижение рОй во вдыхаемом воздухе барокамеры; в) пребывание в термокамере.

Абтурацию трахеи производят путем лигирования, исключая возможность захвата нервных стволов лигатурой. Время выживания животных в состоянии гипоксии (асфиксии) определяют по

30

35

40

45

50

55

Данные гемокоагулограммы обработаны статистически и представлены в табл.4.

Острую токсичность гликуроногликана исследуют в опытах на 78 белых мышах массой 20±2 г по тесту летальной дозы (ЛД) при внутрибрюшинном введении в дозах 50, 1UO, 150, 200, 250, 500, 750 и 1000 мг/кг в объемах до 1 мл. Препаратом сравнения служил гепарин, вводимый в эквимолекулярных дозах. Контрольным животным вводили аналогичные объемы изотонического раствора натрия хлорида. Летальность определяли через 24 ч после инъекции веществ.

Результаты экспериментов представлены в табл.5.

Антигипоксическая активность гликуроногликана представлена в табл.1, 2, 3 (индексом х отмечены результаты, достоверно отличающиеся от контрольных, у - то же, от соответствующей дозы препарата сравнения при ,05).

Антикоагулянтная активность гликуроногликана отражена в табл.4.

Показатели, характеризующие острую токсичность гликуроногликана, представлены в табл.5.

Данные по противогипоксической и антикоагулянтной активности полисахарида (А), полученного предложенным способом из соцветии липы сердцевидной и полисахариды (ЧН), получендлительности сохранения биоэлектрической активности сердца, т.е. данным электрокардиографии (ЭКГ).

Снижение р02 во вдыхаемом воздухе создают в барокамере при скорости подъема на высоту 3U м/с. Результаты опытов, оцениваемые по тесту смертельной площадки, представлены в табл.2.

Антикоагулянтную активность глику- роногликана исследуют на 6 кроликах породы Шиншилла массой 2650±126 г при помощи серийного медицинского гемокоагулографа ГКГМ-4. /Цтя чего раствор гликуроногликана в дозе 13,38 мг/кг и объеме 3 мл медленно вводят в краевую ванну уха кролика. Кровь для исследования (0,1 мл) берут

грамму записывают через 5, 2, 24 и 48 ч после введения гликуроногликана. В качестве контроля используют изотонический раствор натрия хлорида. 5

0

5

0

5

0

5

Данные гемокоагулограммы обработаны статистически и представлены в табл.4.

Острую токсичность гликуроногликана исследуют в опытах на 78 белых мышах массой 20±2 г по тесту летальной дозы (ЛД) при внутрибрюшинном введении в дозах 50, 1UO, 150, 200, 250, 500, 750 и 1000 мг/кг в объемах до 1 мл. Препаратом сравнения служил гепарин, вводимый в эквимолекулярных дозах. Контрольным животным вводили аналогичные объемы изотонического раствора натрия хлорида. Летальность определяли через 24 ч после инъекции веществ.

Результаты экспериментов представлены в табл.5.

Антигипоксическая активность гликуроногликана представлена в табл.1, 2, 3 (индексом х отмечены результаты, достоверно отличающиеся от контрольных, у - то же, от соответствующей дозы препарата сравнения при ,05).

Антикоагулянтная активность гликуроногликана отражена в табл.4.

Показатели, характеризующие острую токсичность гликуроногликана, представлены в табл.5.

Данные по противогипоксической и антикоагулянтной активности полисахарида (А), полученного предложенным способом из соцветии липы сердцевидной и полисахариды (ЧН), полученного из соцветий липы сердцевидной по известному способу сведены в табл.5, 6, 7, 8 и 9.

В табл,6-9 индексом х отмечены результаты, достоверно отличающиеся от исходных; у - то же, от контрол при Р 0,05; М - среднестатические показатели; m - среднестатнческие отклонения от М.

Формула изобретения

Способ получения полисахарида экстракцией растительного сырья с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем,

Таблица 1

Влияние гликуроногликана и гепарина на время сохранения биоэлектрической активности сердца при ябтурации трахеи у мышей (М±п)

Влияние гликуроногликана и гепарина на выживаемость мышей по тесту смертельной площадки (МЈп)

Вещество

г Вре

Доза, мг/кг Время выживания,

мин

Гликуроногликан6,69

Гликуроногликан13,38

Гепарин1,65

Гепарин3,30

Контроль

5

что, с целью получения полисахарида, обладающего противогипоксической н антикоагулянтной активностью, в качестве исходного сырья используют соцветия липы сердцевидной, перед экстракцией растительное сырье дополнительно обрабатывают сначала 10%-ным водным раствором хлористого аммония при модуле 20 и рН 5,8-6,0, а затем 5/Ј-ным раствором дизтилового эфира в этаноле при молуле 50 с последующей сушкой при 35-40 ;, экстракцию проводят водой при 80°С и модуле 30, а выделение - концентрированием экстракта и обработкой двойным объемом этилового спирта при .

Таблица2

г Вре

Вре

11,17±0,38 18,28±0,43Х 6,28+ 1,28 6,Д6±0,19 5,43+0,22

Влияние гликуроногликана и гепарина на выживаемость мыией при гипоксии в термокамере (М i и)

|Доза, мг/кг

Вещество

Т а б л и ц а 4

Влияние гликуроногликана (а) и гепарине (б) и сравнении с контролем (в) на показатели свертываемости крови по данным гемокоагулограммы (М± т)

Примечание:

г - время тромбиновой активности; К - время образования сгустка;; t - константа коагуляции; S г константа уплотнения;Т константа свертывания; та - амплитуда эластичности сгустка; Ci - индекс коагуляции; Е - эластичность сгустка; индексом х отмечены результаты, достоверно отличающиеся от исходных; о - от препарата сравнения (р04 . 0,05).

у - от контроля;

Таблиц аЗ

Время выживания, мин

сти; К - время танта коагуляции; константа свертыности сгустка; ластичность сгустультаты, достовер(р04 . 0,05).

у - от контроля;

Т л б л н

Острая токсичность гликуроногликана и гепарина при внутрибрюшинном введении белым мыгаа (М±го)

Вещество Показатель летальности, мг/кг

Гликуроногликан HATНет Нет

Гепарин 122,3(74,5±170,2) 54,3 190

Таблиц

Влияние полисахаридов А и Н на время сохранения биоэлектрической активности сердца при абтрубации трахеи у мышей (M + tn)

Вещество Доза, мг/кг Время сохранения биоэлектрческой активности сердца, мин

А6,6912,33 ±1,Ob

А13,3813,55 ±0,

Б6,69 8,23±1,20

Б13,3810,07±1,26

Контроль- 7,4Ь±0,25

Табли

Влияние полисахаридов А и Б на выживаемость мышей по тесту смертельной площадки (МЈго)

Вещество|Доза, мг/кг I Время выживания, мин

А6,6911,17±0,

А13,3818,28±0,43Х

Б6,696,87+0,41

Б13,388,12±0,44

Контроль-5,43+0,22

Таблиц

Влияние полисахаридов А и Б на выживаемость мышей при гипоксии в термокамере (М+т)

Вещество|.Доза, мг/кг Время выживания, мин

А6,6938,45-Ю,

А13,3839,19 ч-0,42 Х

Б6,6932,28± 1,31х

Б13,3833,30±2,09

Контроль-28,37+0,34

Влияние полисахаридов Л и В в сраннении с контролем В на показатели свертываемости крови по данным гемокоагулограммы (It t го)

Примечание;

г - время тромбиновой активности; К - время образования сгустка; t - константа коагуля-- ции; Т - константа свертывания; S - константа уплотнения; та - амплитуда эластичности сгустка; Ci - индекс коагуляции; Е - эластичность сгустка.

Таблица9