Способ диагностики анкилозирующего спондилоартрита Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и касается совершенствования способов диагностики ревматических заболеваний, в частности анкилозирующего спондилоартрита (АС).

Целью изобретения является повышение точности способа лабораторно -иагно- стики АС.

Способ осуществляют следующим образом.

После выявления у больных с помощью лимфоцитотоксического теста по Терасаки антигена HLA-B27, проводят количественное его определение в сыворотке крови На первом этапе исследования определяют наибольшее разведение анти-Н1 А-В27 тест- сыворотки, вызывающее гибель не менее 80 клеток-мишеней. Для этого готовят ряд разведений тест-сыворотки, например 1,5-, 2-, 3-, 4-кратные на изотоническом растворе,

например на среде 199. Неразбавленную сыворотку и каждое из приготовленных разведений вносят в объеме 1 мкл в лунки микрокамеры Терасаки. В каждую лунку добавляют по 1 мкл инактивированной общепринятым методом (при 56°С в течение 30 мин) кроличьей сыворотки и инкубируют смесь при 22°С в течение часа, после чего в каждую лунку добавляют по 1 мкл клеток- мишеней в концентрации 2x10 в 1 мл. Клетками-мишенями служат лимфоциты периферической крови здоровых людей, выделенные с использованием градиента плотности фиколл-верографина и имеющие в фенотипе антиген HLA-B27. Инкубацию с клетками-мишенями проводят в течение часа при 22°С. После инкубации в лунки вносят по 5 мкл кроличьего комплемента (пул сывороток крови от 10-15 животных), после чего инкубацию повторяют при тех же уелоOs00

. о

00

со

пичх Пп элв ршении urex процедур клетки- Мишени окрашивают 1% ным раствором трипанопого синего в течение 10 мин и подсчитывают число мертвых окрашенных кле- 701- под микооскопом Все методические приемы, использованные в настоящем способе включая температурный режим время инкубации концентрацию клеток, оценку реякции, описаны в классической методике Герасаки и являются общепринятыми

После окрашивания отмечают лунки, в которых обнаружено не менее 80% мертвых клеток Наибольшее разведение тест-сыво- рогки вызывающее гибель не менее 80% леток мишеней обозначают как К

Одновременно к тем же разведениям тест-сыворотки вместо инактивированной кроличьей сыворотки добавляют по 1 мкл исследуемой сыворотки крови пациента Дальнейшие процедуры не отличаются от приведенных выше После окрашивания клеток мишеней определяют наибольшее разведение тест сыворотки вызывающее гибель не мене 80% клеток-мишеней после преинкубации ее с исследуемой сывороткой пациента и обозначают его как КГ

В ряде случаев исследуемая сыворотка пациента полностью нейтрализует актив ность тест-сыворотки (как ее разведений так и цельной), что не дает возможности определить К R этих случаях исследуемую сыворотку пациента разводят в 2 4, 8 и 16 раз и тестируют каждое разведение описан ным выше способом Отмечают наименьшее разведение (обозначаемое как С ) исгпедуемои сыворотки пациента при ин кубации которою с тест сывороткой может быть выявлена гибель не менре 80% клеток мишеней (Кт)

После определения всех указанных па раметров относительное количество растворимого антигена Н1А В 2 7 в мл сыворотки определяют по формуле

Р юоо с (кк 1 )

где Р количество растворимого антигена в 1 мл исследуемой сыворотки пациента,

1000 коэффициент приведения ре зультатов к 1 мл

С наименьшее разведение исследуемой сыворотки пациента при инкубации ко торой г г ы порот кой может быть выявлена гибпь не менее 80% клеток ми шеней.

К наибольшее разведение тест-сыво рогки вызывающее гибепь не менее 80%

клеток мишеней после преинкубации ее с инактивированной кроличьей сывороткой,

Ki наибольшее разведение тест-сыворотки вызывающее гибель не менее 80%

клеток-мишеней после преинкубации ее с исследуемой сывороткой пациента

Изобретение иллюстрируют следующими примерами.

Пример 1 Больной X , 35 лет, муж

0 Халобы при поступлении, боли в левом локтевом и коленном суставах в правом тазобедренном суставе, в шейном отделе позвоночника. Ограничение движений в позвоночнике и во всех суставах нижних ко5 нечностей Объективно при поступлении: затруднения при ходьбе, щадит правую ногу Болезненность и ограничение движений в коленном и правом тазобедренном суста- рах, ограничение активных движений до

0 почти полного в позвоночнике Положительные симптомы Шобера и Отто Умеренная ригидность грудной клетки Рентгенологические исследования илеосакральные сочленения не просматриваются, деформация

5 обоих тазобедренных суставов за счет сужения суставной щели субхондрального склероза, краевых разрастаний и узур Ротация правого бедра кнутри. Остеоартроз коленных суставов Грудной отдел позвоночника

0 картина бамбуковой палки Лабораторные исследования гемоглобин - 125 г/л, СОЭ 28мм/ч, лейкоциты 11,5х103/л, эози- нофилы 3%, палочкоядерные нейтрофилы 3%, сегментоядерные нейтрофилы - 60%,

5 лимфоциты - 30%, моноциты - 4%, СРП 7+ общий белок 79 г/л альбумин - 56%, т 51%. «2 -9,1%/ 11,4%.у - 18,4%. Ревматоидный фактор отр , анти-ДНК антитела -- 5 г/л.

0 Методом тканевого типирования по Те- расаки в фенотипе обследуемого выявлен антиген HLA-B27.

Количественное определение антигена HI А В27 в сыворотке крови пациента антиЬ HLA B27 проводят как описано выше В (рови больного содержание растворимого антигена HLA- B27 было равно 2000.

Клинический диагноз АС, периферическая форма, II ст, активности, медленно про0 грессирующее течение, IV стадия, Функциональная недостаточность III степени

Пример 2 Больная Ш , 44 л жен Жалобы при поступлении, боли в коленных,

сч голеностопных суставах и мелких суставах тетей рук, боли в области крестцово-под- вздошных сочленений, скованность по утрам общая слабость Обьективно при поступлении отечность болезненность при

движениях в голеностопных суставах. В коленных суставах определяется хруст, треск, при пальпации - баллотирование надколенника, движения ограничены из-за болезненности. В области крестцово-подвздошных сочленений при пальпации отмечается болезненность. Боли при движениях в суставах кистей рук. больше справа. Рентгенологические исследования: в коленных суставах резко сужена суставная щель, имеются костные разрастания до 3 мм, суставные концы костей склерозированы. В пя- стно-запястных суставах некоторое сужение суставных щелей. В голеностопных, крестцово-подвздошных, тазобедренных суставах патологии не выявлено. Лабораторные исследования: гемоглобин - 110 г/л, СОЭ - 56 мм/ч, лейкоциты - 6,6х109/л, эозинофилы - 5%, палочкоядер- ные нейтрофилы - 6%. сегментоядерные нейтрофилы - 59%, лимфоциты - 23%, моноциты -7%, СРП-3+, общий белок-70 г/л, альбумин - 43%, «1 -9%, аг -13%,/5 - 15%, у- 20%. Ревматоидный фактор: реакция Ваалера-Роузе 1:128. латекс-тест 1:320, ДРФ 1:320.

У больной выявлен антиген HLA-B27.

В то же время при количественном определении антигена HLA-B27 в сыворотке крови обнаружено только 500 УЕ этого антигена.

Клинический диагноз: Ревматоидный артрит, полиартрит серопозитивный, III ст. активности, медленно прогрессирующее течение, стадия III, вторичный артроз коленных суставов.

Следовательно, уровень антигена HLA В27 в сыворотке крови свидетельствует об отсутствии у данной больной АС. Клинико- лабораторное обследование бопьной подтвердило достоверность диагноза ревматоидный артрит.

Таким образом, использование предлагаемого изобретения в лабораторной диагностике АС позволяет существенно

повысить ее эффективность за счет увеличения точности диагностики. По сравнению с прототипом увеличивается точность диагностики. Так, по прототипу количество ложно- положительных диагнозов составляет 44%

(из 56 обследованных 25 были здоровыми), а по предлагаемому способу из 56 обследованных точный диагноз был установлен в 100%.

Формула изобретения

Способ диагностики анкилозирующего спондилоартрита, включающий забор крови, выделение лимфоцитов, определение

HLA-B27 фенотипа в лимфоцитотоксиче- ском тесте с тест-сывороткой к антигену HLA-B27, отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики у больного, содержащего HLA-B27 фенотип.

дополнительно из крови выделяют сыворотку, определяют в ней относительное количество HLA-B27 антигена на 1 мл сыворотки в лимфоцитотоксическом тесте с тест-сывороткой и лимфоцитами здоровых лиц, содержащих HLA-B27 антиген, и при величине. равной или выше 1,500, диагностируют ан- килозирующий спондилоартрит

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при диагностике анкилозирующего спондилоартрита. Цель изобретения повышение точности диагностики У больных определяют в лимфоцито- токсическом тесте наличие HLA-B27 фенотип с лимфоцитами больного и тест-сывороткой к этому антигену. Затем в сыворотке больного определяют относительное количество антигена HLA- B27 в лимфоцито- токсическом тесте по конкуренции с HLA- В27 антигеном лимфоцитов здоровых лиц с HLA-B27 фенотипом и при его количестве, равном или больше 1500, диагностируют ан- килозирующий спондилоартрит. По сравнению с прототипом количество ложноположительных диагнозов снижается на 44%.