Способ прогнозирования рецидива тиреотоксикоза Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно эндокринологии, и может быть использовано при хирургическом и кон- - сервативном лечении диффузного токсического зоба.

Цель изобретения - повышение точности прогнозирования рецидива тирео- токсикоза.

Способ осуществляют следующим образом.

Определение антител к рецептору тиреотропина проводят с помощью коммерческого набора фирмы Mallincrodt ФРГ. Метод основан на вытеснении бычьего тнреотропного гормона (БТТГ), меченого 25 I (1/2SI БТТГ) из рецепторов для тиреотропного гормона (ТТГ) на мембранах типеоцитов антителами к рецептору ТТГ. Чем больше.антител находится в исследуемой сыворотке, тем меньше 1251 БТТГ остается связанным с рецепторами.

ным

В виалы из набора с лиофилизированлЛ е

125

бавляют по 2,5 мл дистиллированной воды. Для полного растворения каждую виалу оставляют стоять в течение. 10 мин, периодически встряхипая, избегая образования пены. Реагенты следует использовать однократно, хранение не рекомендуется.

В соответствующие пробирки вносят по 50 мл сыворотки крови больного, сыворотки для позитивного контроля р (из набора), реферанс-сывороткн (из набора). Для определения неспецифического связывания (NSB-non specific finding) вносят 50 мл рсференс сыворотки в отдельную пробирку.

В пробирки добавляют по 100 мл ТТГ- рецепторов (из набора) и тщательно перемешивают на вертушке (Vortex).

«аи.

I БТТГ и ТТГ рецепторами до- 2

ат&

э -1

:сл ос оо

Для определения NSB. в пробирку вместо ТТГ рецепторов добавляют 100 мл дистиллированной воды.

Инкубируют, пробирки при :20°С в течении 20.5 мин.

В каждую затем добавляют по 100 мл 251 БТТГ и тщательно перемешивают (Vortex). Инкубируют при . . в течение 2 п. Добавляют 1 мл полиэтиленгликоля (ПЭГ, из набора) и тщательно перемешивают. Центрифугируют в течение 30 мин при 2s 2500 g (рефрижераторная центрифуга). Сразу после центрифугирования тщательно ас- пирируют супернатант. Преципитат не следует аспирировать.

Оставшуюся активность подсчитывают на V-счетчике. Расчет проводят по формуле..

jl- S

L с

ЈЕП)59Ј5ё5УеЛ1°й Јй22Р215 Л cptn референс-сьшоротки J

хЮО,

где F - содержание антител в ТТГ-рецепторе, %; срт - количество импульсов в 1 мин.

Проба считается положительной, если FЈ15%. .

Неспецифическое связывание должно быть 9%, оно рассчитывается по формуле

. MSB-- - ----. Общая активность

Определение антигенов системы HIA осуществляют при помощи панели типи- рующих сывороток ЛенНИИ гематологии в стандартном микролимфоцитотоксическом тесте двуступенчатым методом.

2 мл гепаринизированной крови (100 ЕД гепарина на 10 мл крови) смешивают с равным объемом среды Хенкса и наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин (плотность 1,076 - 1,077); центрифугируют 30-40 мин при 200 g, аспирируют лимфоциты, находящиеся в интерфазе, и переносят в мерную пробирку; добавляют 2 объема трис буфера и центрифугируют 10 мин при 200 g, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в растворе Хенкса, доводя концентрацию лимфоцитов до 2-4 х tOJ кл/мл.

Типирующие сыворотки в количестве 1 мл вносят в лунки планпетоп Терасл- ки под вазелиновое масло.

Лимфоцитарную взвесь вносят в те же лунки по 1 мл и инкубируют в течение 30 мин при 2.°С вместе с типирую- щей сывороткой. В каждую лунку добавляют по 5 мл свежераэмороженного кроличьего комплемента и инкубируют при 20°С 1 ч.

Планшеты встряхивают для удаления вазелинового масла, вносят в каждую лунку 1 мл трипанового голубого, через 10 мин избыток краски удаляют стряхиванием и учитывают реакцию, клетки, разрушенные антителами, окрашены в голубой цвет и имеют нечеткие контуры.

Определение Т-хелперов (Тц) и Т- супрессоров (Тс) производят с помощью коммерческих моноклональных антител (МАГ) ОКТ-4 и ОКТ-8 (Orto Diagnostics в комплементзависимом микролимЛоцито- токсическом тесте.

Для этих целей лимфоциты периферической крови выделяют на градиенте плотности фиколл - верографин по методу Воушп А.

Лимфоциты собирают из ннтерфазы с помощью пастеровской пипетки, дважды отмывают в среде 199 и ресуспендируют в среде RPMT-1640, содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки в концентрации (2-4)х10э кл/мкл.

В лунки- планшета Терасаки вносят под слой вазелинового масла по 1 мкл Мат в разведениях (1:4)-(Т:640) в среде RPMT 164) с Ю% эмбриональной те- лячь.ей сыворотки, используя 3 лунки для каждого разведения. В каждую лунк добавляют по 1 мкл лимфоцитарной взвеси в концентрации 2-4И О3 кл/мкл и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. В каждую лунку добавляют по 5 мкл цельного кроличьего комплемента и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Затем в каждую лунку вносят по 2 мкл 5%-ного раствора эозина на физиологическом растворе, инкуби- руют 5 мин при комнатной температуре, добавляют по 1 мкл 372-ного формальдегида (РН-7,0).

Клеточную суспензию из каждой лунк переносят в камеру Горяева с помощью микрошприца, где и учитывют результаты реакции, подсчитывают количество нежизнеспособных (окрашенных) и живых клеток (не 200 клеток).

Результат рассчитывают по формуле

100, 100-В

I

где А - количество нежизнеспособных

клеток в опыте, %; В - количество нежизнеспособных

клеток в контроле, %; ЦИ - цитотоксический индекс. Пример 1. Больная 3. 18 лет, поступила D клинику кафедры хирургических болезней № 1 ЛЛМИ 18.06.88 г. для оперативного лечения с диагнозом:

538

Послеоперационный период без осложнений, заживление per prinum. Выписана на 8-й день после оперативного вмешательства .

Осмотрена через 1 месяц после операции. Жалоб нет, больная в эутиреонд- ном состоянии.

Произведено определение антител

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования возникновения рецидива у больных тиретоксикозом. Цель изобретения - повишсние точности способа. У больного осуществляют забор крови, выделение сыворотки и лейкоцитов с последующим выявлением антител к рецептору тиреотропина, HLA-B 8, HLA-DR антигенов, количество Т-хелперов, Т-супрессоров, вычисляют соотношение между Т-хелперами и Т-супрессорами и при обнаружении антител к рецептору тиреотропина, HLA-38, HLA-DR. антигенов и при величине соотношения Т-хелперов к Т-супрессорам, большем 2, прогнозируют возникновение рецидива у больных тиреотоксикозом. По сравнению с прототипом увеличивается точность прогноза на 35%.

ДТЗ. Тиреотоксикоз П. Офтальмопатия П, Q к рецептору тиреотропнна, иммуногенетическое типнрование по антигенам системы HIA, определение субпопуляций лимфоидных клеток методами, описанными выгае.

Результаты: TRAB - 23%; НТ.А фенотип: А1, 19 В7, 40 CW4, DR 1,4, - 1,4. Результаты соответствуют прототипу исследования.

Осмотрена через 1/2 года после операции. Жалоб нет. Больная в состоянии клинического эутиреоза.

Лабораторные исследования: поглощение ™ I 6 ч - 14%, 12 ч - 21%, 24 ч - 28%, 48 ч - 18% (N - 35%„0|гс). Т3 2,1 нмоль/л (,5-2,7); Т - 130 нмоль/л (N 105-170).

Осмотрена через год после операции. Клинический эутиреоз. Тэ 2,2 нмоль/л; 14 - 120 нмоль/.-i.

Через полтора года после операции больная в эгутиреоидном состоянии, Т - 1,9 нмоль/л, 1Ю нмоль/л.

Таким образом, использование предлагаемого способа, обеспечивает повышение точности прогнозирования возникновения рецидива тиреотоксикоза на 35% по сравнению с известным способом благодаря выявлению всего комплекса нарушений иммунного гомеостаза, что позволяет использовать его в клинической .практике для диспансеризации людей группы риска, имея целью раннюю

в состоянии медикаментозного эутиреоза.

В виду того, что данные соответствовали предлагаемому методу, прогнозирована высокая степень риска ВОЗНИКНО-IQ вения рецидива тиреотоксикоза.

Осмотрена через 6 месяцев после оперативного вмешательства. Жалобы на сердцебиение, чувство жара, повышенную возбудимость. Объективно: эмоциональна лабильна, тахикардия 95 Ы1, тремор пальцев рук. Увеличения тирео- идного остатка не выявлено-.

При контрольном лабораторном обсле35

довании обнаружено: поглощение |: 6 ч - 64%, 12 ч - 78%, 24 ч - 76%, 48 ч - 52% (N - 35%waKO). Т, О

3,4 нмоль/л (,5-2,7); Т - 190нмоль/л диагностику и коррекцию возникшего

(N 105-170).

Диагностирован редидив тнреотоксн- ; коза. Больная направлена в эндокринное- отделение для проведения тиреостатичес- кой терапии.

i

i

Пример 2. Больная И., 21 г, поступила в хирургическую клинику 22.12.87 г. с диагнозом: ДТЗ III. Тиреотоксикоз IT, в состоянии медикаментозного для оперативного лечения.

)

нарушения, С помощью предлагаемого способа точность диагностики составляет 81,4%, а с помощью известного - 46,1%..

Формула изобретения

Способ прогнозирования рецидива тиреотокснкоза, включающий забор крови у больного, выделение сыворотки и определение в ней антител к рецептору тиреотропина, отличаюцнй- с я тем, что, с целью повышения точности способа,из крови больного.дополнительно выделяют лимфоциты и определяют антигены HLA-B8, HLA-DR},

35

О

нарушения, С помощью предлагаемого способа точность диагностики составляет 81,4%, а с помощью известного - 46,1%..

Формула изобретения

Способ прогнозирования рецидива тиреотокснкоза, включающий забор крови у больного, выделение сыворотки и определение в ней антител к рецептору тиреотропина, отличаюцнй- с я тем, что, с целью повышения точности способа,из крови больного.дополнительно выделяют лимфоциты и определяют антигены HLA-B8, HLA-DR},

71707538 Л

количество Т-хелперов, Т-супрессоров,HLA-B8, HLA-DR антигенов и соотношевычисляют соотношение между Т-хелпе--ния Т-хелперов к Т-супрессорам, больрами и Т-супрессорами и при выявле-тем 2, прогнозируют рецидив тиреотокнии антител к рецептору тиреотропина,сикоза у больного.