Способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных Советский патент 1981 года по МПК C12N9/88 

Изобретение относится к биохимии и касается исследований в энзимологии. . Известен способ определения орнн- тиндекарбоксилазы в тканях животных путем инкубации их с орнитином с пос ледующим проведением реакции .динитрофенилирования и колориметрией конечного продукта . Однако известный способ не обеспе чивает высокой точности. Цель изобретения - повьшение точности способа. Указанная цель достигается тем, что способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных осуществляют путем инкубации их с орнитином с последуюю;им проведением реакции динитрофенилирования и колориметрией конечного продукта, ткани перед инкубацией гомогенизируют в присутст вии пиридоксальфооЬата и дитиотреитола, взятых в соотношении 4:1 иякубацию ведут также в присутствии пос.ледних,затем инкубаты обрабатывают хлорной кислотой, центрифугируют .а к супернатанту перед динитрофенилированием добавляют Пример. Орнитиндекарбоксилаза (ОДК) не выдерживает замораживания, поэтому в качестве источника фермента используют свежеприготовленш супернатант 33%-ного гсммогеиата (из расчета 1:2 вес на объем), полученшлй центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Ткань, гомогенизируют в 0,05 мМ фосфатном буфере (рН 7,2), содержащим 0,1 ммоль/л дитиотреитол и 0,4 ммоль/л пиридоксальфосфат. Все манипуляции с тканью проводят на холоде при 2-4 С. Инкубационная смесь содержит в 0,4 МП конечного объема 4 ммоль орнитина 20 мкмоль пиридоксальфосфата. 5 мкмоль дитиотриетола. 5 ммоль К, а-фосфатного буфера и 9,5±0,68 мг белка (источник фермента) . Водное термостатирование при ЗУС прекращают через 1 ч и добавляют Q, мл 0,2 М НС104. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин. Количество образовавшегося путресцина определяют с помощью 2,4-динитроН фторбензола (ДНФВ). Дпя динитрофенилирования берут 0,3 мл супернатанта, 25 мг NaftCOvlOH O и 0,3 мл реактива, содержащего ДНФБ, который готовят непосредственно перед работой, смешивая реактив. А (0,65 мл ДНФБ в 50 мл ацетона) с реактивом В (о,066 М раство.р МапВд О-у) в соотношеггаи 1:10, Образование ДН 1 -производных ортштина и путресцина осуществляют в водяной бане при 60-70°С в течение 10 мин. ДНФ-путресцин извлекают энергичным встряхи ва1шем с 4 мл хлороформа и центрифугируют яри 5000 об/мин в течение 10 мин. ДПФ-орнитин остается в водя ной фазе. Интенсивность поглощения света хлороформенным слоем измеряют при 350 нм на спектрофотометре Контролем слу:(шт проба, в которую орнитин добавляют непосредственно перед диш1трофенилиг)ованием. Калибр вочную кривую строят для стащ1артно го Препарата иутреспина 2НС1. Устра Heiffle перед динитрофенилированием.щ анализируемой пробы белка центрифугированием после добавления НС104 увеличивает возврат до 102,97+2,22% Для нейтрализации НСЮ и защелачивання фазы до рН 9 добавляют порошок МэлСОл-ТО . Дитиотреитол используют для стабилизации дисульфидных связей ОДК. Добавление пиридоксаль- фосфата улучшает воспроизводимость результатов. Качественньй состав и количественное соотношезше компоиен тов инкубационной среда. подбирают заново. За единицу активности принимают 1 нмоль путресцина, образованного за 1 ч при ЗУС. Удельную активност фермента (А) выражают в единицах активности на 1 мг белка. Белок оп ределяют по методу Лоури. Результаты, опытов подвергают ста тистической обработке методом Монце вичюте-Эрингенё с использованием фактора Монденгауэра. Различия межд 4 генеральными средними (X) расценивают как достовернь е при значении pjf 0,05. Объектом исследования служат штаммы перевивных гепатом Г-27, Г-46, регенирирующая печень, печень интактных животных и животных, получивших канцероген: диэтилинтрозоамин (ДЭНА), Гепатому Г-46 пассируют на самцов мьшей линии СЗНА. В остальных опытах используют беспородных крыс. Частичную гепатоэктомию проводят по методу Higgins и Anderson. ДЭНА вводят внутрибрюшинно один раз в неделю в течение двух месяцев из расчета 100 мг/кг веса животного. Всего каждому животному вводят 154 мг концерогеНа. Ошибка метода менее 3%, чувствительность равна ±.0,1 нмоль пробу, воспроизводимость результатов близка к 100%. Зависимость оптической плотности (ДД350) от содержания ДНФ-путресцина в пробе сохраняет линейный характер в диапазоне от О до 150 нмоль. Оптимум рН для ОДК остается постоянным в узкой зоне значений от 6,4 до 6,8 и не зависит от рН буфера для гомогенизации, в то время как удельная активность ОДК снижается при рН 6,6, Обнаружено высокодостоверное увеличе1-ше активности ОДК в регенерирующей печени, печени животных, получавших ДЭНА, и гепатомах Г-27 и Г-46. Предлагае1 1ый способ позволяет повысить точность и чувствительность способа. Формула изобретения Способ определения орнити1щекарбоксилазы в тканях животных путем инкубации их с орнитином с последующим проведегшем реакции динитрофенилирования и колориметрией конечного продукта, отличающийся тем, что, с целью повьш1ения точности способа ткани, перед инкубацией гомогенизируют в присутствии пиридоксаль-. фосфата и дитиЬтреитола, взятых в соотношении 4:1, инкубацию ведут также в присутствии последних, затем инкубаты обрабатывают хлорной кис58594406

лотой, центрифугируют,а к супернатан-1. Зйкревский В.П. Определение

ту перед динитрофенилированием до-орнитиндекарбоксилазы у микрооргакизбашшгот .мов с помощью 2 -динитро-1-фторбенИсточники информации, 5 градского мединститута, 1973, т.26,

принятые во внимание при экспертизес.375,

.зола. Сборник научных работ Волго-