Способ иммунологического анализа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методам определения антигенов с помощью иммунологических тестов.

Целью изобретения является повышение реакционной способности в отношении тестирования высокомолекулярных антигенов.

На фиг.1 дана схема осуществления предлагаемого способа; на фиг.2 - график зависимости инактивации ВОЕ от концентрации ВШ.

Пример 1. В качестве антигена используют суспензию очищенного вируса, выделенного из больных пло довых тел шампиньонов (A.bisporus,) (ВШ), спектрофотометрически определяют его концентрацию - 3 мг/л. Путем иммунизации кроликов ВШ получают антисыворотку - , определяют ее титр в реакции двойной радиальной иммунодиффузии (1:128) и количество иммуноглобулинов фракции IgG - 2 мг/л. Параллельно получают антисыворотку к бактериофагу Т4Д (АСт), специфичному в отношении бактерий E.coli и определяют максимальное ее разведение, нейтрализующее 95-100% фаговых частиц при их концентрации 500-1000 в 1 мл, это разведение составило 1:500, Готовят также раствор бычьего сывороточного альбумина - БСА - 0.2% и протеина А - 15 мкг/мл в калий-фосфатно-соле- вом буфере /КФСБ), рН 7,5.

Для проведения реакций антисыворотки протеин А используют в заведомо избыточных концентрациях, т.е. в концентрациях, выше необходимых для протекания реакции: АС6Ц|- 1:100, ACq,оъ

00 00

СЕ Јь

1:100, протеин Л 1Ь мг/мл, непроре- агировавшие остатки реагентов отмывают трижды по 2 мин 0,05М КФСБ с до бавлением 0,1% Тиина/20 и один раз дистиллированной водой (используют стерильные растворы и стерильные инструменты и посуду).

Реакцию проводят в лунках полистироловых планшетов. В лунки вносят по 100 мкл десятикратных разведений суспензии ВШ, в качестве отрицательного контроля вносят суспензию вируса табачной мозаики (ВТМ) - 3 мг/мл, а также КФСБ. Анализ осуществляют в трех повторностях.

Сорбцию антигенов проводят в течение ночи при 4°С.После промывания лунок в них последовательно вносят (с промежуточными промываниями) БСА,АСВид, протеин А, АС ., 100-200 БОЕ бактерио-- га Т4/(. Инкубацию всех реагентов, кроме бактериофага, осуществляют при 37°С в течение 1 ч, тктериофа

а - при 4°С в течение; ночи.

После инкубации содержимое лунок с бактериофагом асептически переносят в слой питательного агара, напри мер МПА, с культурой E.coli в чашках Петри (по методу Грациа) и инкубируют при 37°С от 6 до 18 ч. Подсчитывают число негативных колоний (БОЕ), образованных на бактериальном газоне, и по сравнению с результатами отркцательных контролен (КФСБ, ВТМ) определяют число нейтраггчзованных БОЕ (сред нее из трех повторноетей) По полученным данным в системе координат вы0

,.,

5

5

0

35

черчивают график зависимости инактивации БОЕ от концентрации ВШ (фиг.2).

Пример2. В качестве антигена используют раствор полиэдрина - белка оболочки вирусов ядерного поли- эдроза вирусов непарного шелкопряда (концентрация 3 мг/мл), получают к нему кроличью антисыворотку (титр 1:128), иммунологическую реакцию ставят по вышеприведенной схеме.

Как следует из полученных результатов, чувствительность предлагаемого иммунологического теста при анализе ВШ составила не ниже 3 фг/мл, а полиэдрина - 0,3 фг/мл, что сопостави мо с чувствительностью других методов на основе вироиммуногестов (ВИТ), применяемых для относительно простых органических веществ.

Формула изобретения

Способ иммунологического анализа, включающий инкубирование исследуемого антигена со специфическими анти- телами, антителами к бактериофагу и бактериофагом, дальнейшим высевом реакционной смеси на газон тест-культуры и учетом результата по наличию зон лизиса тест-культуры, отличающийся тем, что, с целью повышения реакционной способности в отношении тестирования высокомолекулярных антигенов, антитела к искомому антигену и антитела к бактериофагу связывают путем добавления протеина А.

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методам определения антигенов с помощью иммунологических тестов. Целью изобретения является повышение реакционной способности в отношении тестирования высокомолекулярных антигенов. Дпя этого дополнительно добавляют в смесь антигена и специфических антител ггоотеин А и антисыворотку к бактериофагу, При этом учет реакции осуществляется по степени нейтрализации биологического действия бактериофага, добавляемого на заключительной стадии постановки реакции. 2 ил. с S

о

о

I О :

,

-L о J-- Г о

-г 4 + + e-j.« .f

+ АС8ш+Пр.А+АС(р+Фог.

Фиг.1

о

4- СН СЯ GH

Ј.coli

E.cotl

/С&Щияяд 2

25

fi0q/77/}pS 6 f t /

о -/ зл ж Ц W

мг3(мл нг/мл лкг/мл дзг/мл Ф „ Концентрация он/лигеноб

/