Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммунобиотехнологии, и может быть использовано при цифровой обработке изображений зон лизиса на индикаторном бактериальном газоне, которые образуются при постановке реакции антиген-антитело, основанных на принципе фаговой метки (фагоиммунотест или вироиммунотест).
В 60-х годах прошлого столетия при разработке новых иммунохимических методов наряду с изотопными и ферментными метками в качестве метки были предложены бактериофаги [1-4], которые выявляются по степени лизиса индикаторной бактериальной культуры.
1.Метод нейтрализации бактериофага. Первые иммунологические методы с использованием бактериофагов были основаны на реакции нейтрализации фага и использовались для изучения иммунного ответа [5, 6]. Сыворотки, полученные против фага, обладают выраженной нейтрализующей активностью. При добавлении сыворотки в разных разведениях к одинаковому количеству бактериофага и последующем его пересеве на микрокультуру чувствительных к нему бактерий происходит снижение его биологической активности. Было подсчитано, что для нейтрализации одной частицы фага при оптимальной посадке антител на поверхность фага ϕХ174 теоретически достаточно 7-8 молекул. Однако при проведении конкретных опытов оказалось, что необходимо в 1000 раз большее количество молекул антител [7]. Реакцию нейтрализации фага обычно учитывают по тому разведению антисыворотки, которое на 50% инактивирует бактериофаг, взятый в опыт. Чувствительность реакции можно увеличить, добавляя второе антитело против иммуноглобулиновых детерминант антител, присоединившихся к фагу [5, 6].
2. Метод торможения нейтрализации фага. Наряду с определением количества антител, метод нейтрализации бактериофага позволял также определять и количество самих гаптенов. Это достигалось путем торможения реакции нейтрализации конъюгата фага при добавлении специфического антигена (гаптена). Для проведения реакции торможения нейтрализации сначала подбирали количество антител, способных инактивировать на 90-95% конъюгат в пробе. Далее, подобранное таким образом количество антител смешивали с неизвестным количеством определяемого антигена и инкубировали их вместе оптимальное время. Антиген в зависимости от его количества полностью или частично блокирует активность антител. В результате нейтрализующая способность антител будет тормозиться в разной степени, что позволяет количественно определять концентрацию антигена. На основании данных, полученных при использовании известных количеств антигена, строилась количественная кривая, которая отражала зависимость: чем больше антигена в пробе, тем на меньший процент будет нейтрализована реакция с конъюгатом. В дальнейшем принципы метода нейтрализации фага были распространены на определение антигенов с большим молекулярным весом и антител против них. На модели фаг-гаптен была изучена аффинность антител разных классов, а также их (Fab')2- и Fab'-фрагментов.
3. Конъюгаты фага с антигеном. Для конъюгирования белковых антигенов с фагом применяли бифункциональные реагенты (глютаровый альдегид, бис-бензидин, карбодиимид, диизоцианаты и др.). При синтезе конъюгатов возникали значительные трудности. При модификации фагов необходимо было получить интенсивно меченые препараты бактериофагов с сохранением их жизнеспособности. Необходимо было для каждого белкового антигена, в зависимости от его молекулярной массы, подобрать такие условия, чтобы присоединенный антиген не блокировал фаг стерически, но при этом количество его было достаточным для инактивации конъюгата фага антителами. Метод обладал высокой чувствительностью, как в реакции нейтрализации бактериофага (10-500 пкг/мл), так и в реакции торможения нейтрализации (25-50 пкг/мл), но оказался слишком сложным [6, 8].
4. Иммуносорбентный вариант фагоиммунотеста. Позже был разработан иммуносорбентный вариант фагоиммунотеста как для определения антител, так и антигенов [2, 9]. Иммуносорбент, синтезированный на разных основах, благодаря своей большой емкости, позволяет извлекать исследуемое вещество в незначительных количествах из сложной смеси, концентрируя его на своей поверхности. Иммуносорбентный принцип был использован в фагоиммунотесте для определения антител к фагу путем извлечения комплексов фаг-антитело. Было показано, что при сорбции фага, нагруженного кроличьими антителами, на сорбенте, связанном с антителами против иммуноглобулина кролика, можно обнаружить противофаговые антитела в количестве, составляющем доли пикограмм [9]. Аналогичный прием использовали Pestka с соавторами [10] для обнаружения противогаптенных антител с помощью фагов, конъюгированных с гаптенами. В этом варианте метода чувствительность по сравнению с методом нейтрализации фага была выше на несколько порядков.
Иммуносорбентный вариант фагоиммунотеста был разработан для определения дифтерийного токсина [11]. Для получения конъюгата в данном случае использовали очищенные антитела. Антитела предварительно активировали глютаровым альдегидом и после освобождения от его избытка присоединяли к бактериофагу. С помощью полученного конъюгата можно было определить антиген в концентрации 50 пкг/мл.
Однако вышеуказанный вариант фагоиммунотеста предусматривал способ получения конъюгата. С помощью глютарового альдегида антитела фиксировались на бактериофаге беспорядочно, тем самым создавались стерические препятствия для взаимодействия с антигеном, что снижало чувствительность метода. Кроме того, глютаровый альдегид инактивирует биологическую активность бактериофага.
В дальнейшем Скворцов В.Т. [7] предложил более эффективный вариант иммуносорбентного фагоиммунотеста для прямого определения антигена. Данный вариант фагоиммунотеста отличался способом получения конъюгата. Бактериофаг φХ174 конъюгировали с Fab'-фрагментами антител, полученными перевариванием антител пепсином. Для синтеза конъюгатов был использован реагент N-ацетил-DL-гомоцистеин-γ-тиолактон. Это позволило предварительно вводить в капсид бактериофага активную SH-группу, которая в результате активации избирательно реагировала со свободной тиогруппой Fab'-фрагментов антител, находящейся на противоположном конце от активного центра. Таким образом, активный антительный центр в конъюгате был оптимально ориентирован для последующего взаимодействия с антигеном.
Этот принцип также был применен для синтеза высокоемкого иммуносорбента с ориентированно присоединенными Fab'-фрагментами антител для получения антигенов. Для синтеза конъюгатов к бактериофагу присоединяли радикал, содержащий свободную сульфгидридную группу, которую далее переводили в смешанный дисульфид с помощью реактива Элмана (5,5-дитиобис(2-нитробензойной кислотой)). Fab'-фрагменты антител, добавленные к бактериофагу, активированному таким образом, присоединялись за счет реакции тиолдисульфидного обмена. С помощью этого варианта иммуносорбентного фагоиммунотеста можно было определить до 3,0 пкг/мл антигена. Для прямого определения антиген в разных разведениях добавляли к пробам иммуносорбента и после инкубации сорбент отмывали забуференным физиологическим раствором. Пробы переносили в чистые пробирки, добавляли конъюгат и инкубировали. После инкубации сорбент отмывали от неприсоединившегося конъюгата, добавляли дитиотреитол, разрушая тем самым дисульфидную связь между бактериофагом и Fab'-фрагментами антител, что приводило к восстановлению биологической активности фага. Количество присоединившегося конъюгата определяли при пересеве проб (после восстановления биологической активности бактериофага) на чашке Петри с индикаторной культурой микробов на твердой питательной среде. В зависимости от концентрации антигена в пробе на чашке с индикаторной культурой появлялось определенное количество зон лизиса (бляшек).
Несмотря на высокую чувствительность иммуносорбентного фагоиммунотеста, метод был использован лишь в лабораторных исследованиях, так как для проведения анализа требовались большой объем работы и лабораторной посуды.
5. Скрининговый вариант фагоиммунотеста. Метод иммуносорбентного фагоиммунотеста оказалось возможным упростить. Был разработан скрининговый вариант фагоиммунотеста с использованием конъюгата фага ϕХ174 и ориентированно присоединенных к нему Fab'-фрагментов антител. Иммуносорбентный этап анализа проводили в 96-луночных полистироловых планшетах, что значительно упростило постановку метода и увеличило количество анализируемых проб. Схема проведения анализа на начальных этапах не отличалась от ИФА с использованием техники «сэндвич». Такой вариант фагоиммунотеста, описанный авторами [12], был разработан на модельном опыте, для определения IgG кролика, с использованием поликлональных Fab'-фрагментов антител и по чувствительности не уступал аналогичным по схеме постановки вариантам ИФА.
Вышеописанный вариант фагоиммунотеста обладает неоспоримым преимуществом по сравнению с ранее предложенными методами с использованием в качестве метки бактериофагов и по простоте выполнения анализа приближался к широко применяемому методу ИФА. Достоинства данного метода (высокая чувствительность, возможность тестирования большого количества проб, относительно короткое время проведения анализа - 6 часов, а также использование более доступной метки - бактериофагов) послужили основой для разработки и совершенствования метода в плане рутинного применения в клинике в качестве быстрого и эффективного метода определения α2- и γ-интерферонов. В результате был разработан оригинальный скрининговый вариант фагоиммунотеста для анализа интерферона в биосубстратах, включающий синтез конъюгатов на основе бактериофага ϕХП4 с ковалентно присоединенными Fab'-фрагментами моноклональных антител против α2- и γ-интерферонов [13]. Использование фагоиммунотеста для анализа интерферонов позволило выявить α2- и γ-интерфероны в растворах и в биологических жидкостях в концентрации до 1,0-1,5 МЕ/мл в течение 5-6 часов. Проведенный сравнительный анализ данных определения интерферонов с помощью высокочувствительного биологического теста и фагоиммунотеста не выявил существенной достоверной разницы между этими показателями (Р<0,05) [13].
В целом, антигенные и антительные диагностикумы, основанные на принципе фаговой метки (фагоиммунотест или вироиммунотест), были разработаны для:
- определения концентрации интерферонов α и γ;
- определения концентрации γ-глобулинов;
- выявления хламидийного ЛПС;
- выявления ростового фактора нервных клеток;
- выявления дифтерийного токсина.
Получение диагностического результата основано на визуальной оценке оператором изображений зон лизиса. Ниже представлена типовая методика постановки фагоиммунотеста (вироиммунотеста) на примере диагностики хламидий с использованием «ХламиВироскрина». Тест-система представляет собой набор реагентов для выявления липополисахаридного антигена (ЛПС) хламидий вироиммунотестом. Для постановки реакции по известному способу в каждую лунку 96-луночного планшета вносят по 0,05 мл раствора моноклональных антител к ЛПС хламидий. Планшеты накрывают крышкой и инкубируют при 37°С 1 ч или при комнатной температуре 18 ч. Затем содержимое лунок вытряхивают и промывают забуференным физиологическим раствором с твином-20 (ЗФРТ). В лунки С6 и D6 вносят по 0,025 мл положительного контроля, в лунки С7 и D7 - по 0,025 мл отрицательного контроля, а в остальные лунки - по 0,025 мл исследуемых сывороток, причем каждую из сывороток исследуют в двух лунках. Затем во все лунки вносят по 0,025 мл раствора конъюгата (фаг-антиЛПС хламидий). Планшет закрывают крышкой и инкубируют 2 ч или ночь при 37°С. Во время инкубации планшета готовят питательный агар. Содержимое лунок планшета после инкубации вытряхивают и промывают ЗФРТ, после чего в каждую лунку вносят по 0,05 мл восстанавливающего реагента, планшет закрывают крышкой и помещают на 30 мин в термостат при 37°С. Во время инкубации планшета готовят индикаторные газоны. Для этого 2 полистироловые пластинки обрабатывают спиртом и помещают на горизонтальный столик. В ампулу с индикаторной культурой E.coli вносят 1 мл ЗФРТ, перемешивают и переносят полученную суспензию в пробирку с расплавленным агаром, имеющим температуру 42-48°С, пробирку немедленно вынимают из водяной бани, быстро перемешивают содержимое, вращая пробирку между ладонями, и немедленно выливают на пластинку, равномерно распределяя агар по всей площади пластинки (с помощью той же пробирки). Таким способом готовят два индикаторных газона. Агару дают застыть. Пластинки с индикаторными газонами должны быть приготовлены за 5-15 мин до окончания инкубации планшета, так чтобы агар успел застыть, но не успел подсохнуть. Пробы из каждой лунки планшета ориентированно переносят на агар с помощью 96-канального аппликатора, полые наконечники которого расположены соответственно лункам планшета. Аппликатор вставляют в планшет и осторожным постукиванием по боковым стенкам планшета добиваются равномерного насасывания жидкости в наконечники. Аппликатор осторожно ставят на агаровую пластинку и слегка «пошевеливают», не отрывая от поверхности агара, а затем убирают, поднимая вертикально, так, чтобы не размазать «отпечатки» - капли, перенесенные на поверхность агара. Аппликатор вновь вставляют в планшет и переносят пробы на вторую агаровую пластинку. Аппликатор используется многократно. После каждого анализа аппликатор тщательно отмывают водой с детергентом, смывают детергент, ополаскивают дистиллированной водой и обрабатывают спиртом. Пластинки накрывают неиспользованной пластинкой или крышкой от планшета, предварительно обработанными спиртом, скрепляют кусочками липкой ленты или пластыря и инкубируют при 37°С в течение 3 ч. Если за это время капли не впитываются в агар, пластинку оставляют на 5-10 мин при комнатной температуре без крышки, после чего оценивают результаты. Результаты реакции учитывают визуально по наличию прозрачных зон лизиса бактерий в месте нанесения проб. Реакция считается положительной, если в месте нанесения пробы образуется сплошная зона лизиса или отдельные бляшки (не менее 6). Число бляшек в месте нанесения отрицательного контрольного образца не должно превышать 3.
Однако, в данном методе учета результатов реакции фагоиммунотеста результат не всегда может быть выражен в точном цифровом измерении. Прежде всего, это касается ситуации, в которой наблюдается слияние зон лизиса на индикаторном газоне.
Техническим результатом изобретения является повышение точности анализа изображений реакции фагоиммунотеста в планшетах, пластинках и чашках Петри, исключение субъективности оценки изображения и введение количественных показателей для изображений бляшкообразующих единиц и оценки суммарной площади зон лизиса.
Технический результат достигается тем, что в способе оценки результатов фагоиммунотеста, предусматривающем анализ зон лизиса микробной индикаторной культуры в лунках планшета с опытными и контрольными тестами, согласно изобретению, планшет с опытными и контрольными тестами последовательно помещают в фотографическую или сканирующую установку для получения оцифрованного изображения зон лизиса, далее обрабатывают каждое оцифрованное изображение с помощью адаптивного фильтра с получением оконтуренных отдельных зон лизиса различных размеров, а также слившихся зон лизиса, затем определяют среднюю суммарную площадь зон лизиса для опытных и контрольных образцов и при превышении величины средней суммарной площади зон лизиса в опыте над величиной средней суммарной площади зон лизиса в контроле не менее чем на 5% фагоиммунотест считают положительным.
Кроме того, оценку результатов фагоиммунотеста проводят автоматизированно.
Сущность способа. В чашках Петри, культуральных планшетах и пластинках, содержащих различные среды, первоначально проводится первичная обработка изображений с поставленной реакцией фагоиммунотеста. Первичная обработка включает в себя: оцифровку изображения всего планшета (пластинки или чашки Петри) с помощью сканера или фотоаппарата, обеспечивающего получение изображений реакций фагоиммунотеста с использованием слайд-модуля или фотоаппарата, фиксацию на оцифрованном изображении планшета (пластинки или чашки Петри) базовых координат, разрезание изображения планшета (пластинки или чашки Петри) на отдельные изображения и последующее их сохранение. Полученные отдельные изображения подвергаются вторичной обработке. Для получения изображений с планшетов, пластинок или чашек Петри используются специально подобранные режимы сканирования или фотографирования с изменением параметров яркости и контрастности, а также цветности. Обработка оцифрованных изображений при помощи адаптивного фильтра позволяет получить четкое оконтуривание бляшкообразующих единиц (БОЕ) различных размеров, а также слившихся БОЕ (см. фиг.1). Оконтуривание БОЕ как одиночных, так и слившихся, позволяет дифференцировать зоны лизиса от индикаторного газона и в результате определять суммарную площадь лизиса, входящую в выделенные зоны (см. фиг.2). Суммарное выделение площадей лизиса позволяет осуществлять количественную оценку суммарного числа фагов в данной тестируемой пробе, т.е. объективно и автоматически учитывать результаты фагоиммунотеста.
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг.1 приведен пример 96-луночной пластинки с проведенной постановкой фагоиммунотеста.
На фиг.2 приведено выделение зон лизиса E.coli С фагом ϕХ174 путем оконтуривания БОЕ.
На фиг.3 приведен пример определения специализированной компьютерной программой площади оцифрованных и оконтуренных зон лизиса E.coli С фагом ϕХП4 с указанием отдельных зон лизиса и групп слившихся зон лизиса.
На фиг.4 приведен пример оценки результата фагоиммунотеста, исходя из определенной площади опытной и контрольной лунки, имеющих разное количество зон лизиса.
Пример.
После постановки реакций в лунках планшета (в чашке Петри или на пластинке), как описано выше, в соответствии с инструкцией по применению диагностикума, планшет с тестами помещается в специально доработанный сканер или фотографическую установку, обеспечивающие оцифровывание изображений. С помощью разработанной специализированной компьютерной программы проводится сканирование и, в случае постановки реакции на пластинке, осуществляется разрезание оцифрованного изображения на отдельные «лунки». Далее программа обрабатывает каждое отдельное оцифрованное изображение с помощью адаптивного фильтра, в результате получаются оконтуренные отдельные зоны лизиса различных размеров, а также слившиеся зоны лизиса. Программа распознает типы зон лизиса и распределяет их по группам, затем она вычисляет среднюю суммарную площадь зон лизиса в конкретном изображении. Далее, исходя из схемы эксперимента, определяют соответствие полученных значений площади зон лизиса для контрольных и опытных образцов. Оценку результатов фагоиммунотеста производят путем определения отношения средней суммарной площади зон лизиса в опытных образцах к средней суммарной площади зон лизиса в контрольных образцах. Превышение средней суммарной зоны лизиса в опыте над таковой в контроле считается положительным результатом; при этом конкретная пороговая цифра определяется для каждого варианта тест-системы отдельно, однако она должна отличаться от контроля не менее чем на 5%.
Результаты анализа приведены в таблицах 1-5.
Автоматизированный учет результатов фагоиммунотеста: общая площадь зон лизиса
Автоматизированный учет результатов фагоиммунотеста: площадь зон лизиса по группам
Данные статистической обработки автоматического учета результатов фагоиммунотеста для иммунодетекции F.tularensis
Оценка фагоиммунотеста для иммунодетекции F.tularensis на 96-луночной пластинке по формуле Р=(Опыт/Контроль)·100%; пороговое значение 105%.
Параметры расчета:
1. Основным параметром расчета, по которому определяется значение реакции фагоиммунотеста и различие между опытом и контролем, а также между отдельными тестируемыми образцами, является общая площадь зон лизиса при разведении реакционной смеси (см. табл.2 и табл.4). Площадь лизиса по группам является вспомогательным дополнительным параметром, который позволяет оценить величину реакции в момент, когда отдельные зоны лизиса начинают сливаться: чем больше слившихся зон лизиса и их площадь, тем сильнее реакция.
2. Статистическая обработка данных, полученных в приведенном выше опыте, иллюстрирует изменение интенсивности реакции фагоиммунотеста при изменении концентрации антигена (ЛПС F.tularensis), а также указывает на значительное различие между опытными и контрольными пробами.
Ссылки
1. Скворцов В.Т., Суслов А.П. Вироиммунотест для массовых определений нанограммовых количеств антигена. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1988. - №12. - С.704-706.
2. Haimovich J., Sela M. Protein-bacteriophage conjugates: Application in detection of antibodies and antigens. // Science. - 1969. - V.164. - P.1279-1280.
3. Haimovich J., Sela M. Inactivation of poly-DL-alanyl poly-DL-alaT4 with antisera spesific toward poly-DL-alamine. // J. Immunol. - 1966. - V.97, №3. - P.338-343.
4. Macela O. Assay of anti-hapten antibody with the aid of hapten-coupled bacteriophage. // Immunology. - 1966. - V.10, №1-2. - P.81-86.
5. Haimovich J., Hurwitz E., Novic N., Sela M. Preparation of protein-bacteriophage conjugates and their use in detection of anti-protein antibodies. // Biochem. Biophis. Acta. - 1970. - V.207. - P.115-124.
6. Haimovich J., Hurwitz E., Novic N., et al. Use of protein-bacteriophage conjugates in quantitation of proteins. // Biochem. Biophis. Acta. - 1970. - V.207. - P.125-129.
7. Скворцов В.Т. Определение ультрамикроколичеств антител и антигенов при помощи вироиммунотеста. В сб.: Иммуносорбенты и их использование в биологии. - M.: - 1986. - С.49-60.
8. Andreev J.M., Mamas S., Dray F.Viroimmunoassay of prostaglandin F2athe picogramm level. // Prostaglandins. - 1974. - V.6. - P.15-22.
9. Скворцов В.Т., Бондаренко В.M. Определение ультрамикроколичеств антител к бактериофагу, основанное на специфическом извлечении комплексов фаг-антитело с помощью иммуносорбентов. // Вопр. вирусол. - 1971. - №4. - С.603-605.
10. Pestca S., Rosenfeld H., Harris R. Communication to the editor viroimmunoassays: detection of virus-antigen, antibody complexes with an immunoadsorbent. // Immunochemistry. - 1974. - V.I 1. - P.123-218.
11. Скворцов В.Т., Вертиев Ю.В. Использование вироиммунотеста для количественного определения дифтерийного токсина. // Лаб. дело. - 1981. - №4. - С.437-439.
12. Скворцов В.Т., Суслов А.П. Вироиммунотест для массовых определений нанограммовых количеств антигена. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1988. - №13. - С.704-706.
13. Скворцов В.Т., Болога В.Ф., Денисов Л.А., Малиновская В.В., Ветчинин С.С., Гречко Г.К., Хлебников В.С., Миллер Г.Г., Суслов А.П. Скрининговый вироиммунотест для определения α2- и γ-интерферона человека в биологических жидкостях. // Иммунология. - 1995. - №2. - С.26-28.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммунобиотехнологии, и может быть использовано при цифровой обработке изображений зон лизиса на индикаторном бактериальном газоне, которые образуются при постановке реакции антиген-антитело, основанных на принципе фаговой метки (фагоиммунотест или вироиммунотест). Способ оценки результатов фагоиммунотеста предусматривает анализ зон лизиса микробной индикаторной культуры в лунках планшета с опытными и контрольными тестами. Планшет с опытными и контрольными тестами последовательно помещают в фотографическую или сканирующую установку для получения оцифрованного изображения зон лизиса. Далее обрабатывают каждое оцифрованное изображение с помощью адаптивного фильтра с получением оконтуренных отдельных зон лизиса различных размеров, а также слившихся зон лизиса. Затем определяют среднюю суммарную площадь зон лизиса для опытных и контрольных образцов и при превышении величины средней суммарной площади зон лизиса в опыте над величиной средней суммарной площади зон лизиса в контроле не менее чем на 5% фагоиммунотест считают положительным. 5 табл., 4 ил.
Способ оценки результатов фагоиммунотеста, предусматривающий анализ зон лизиса микробной индикаторной культуры в лунках планшета с опытными и контрольными тестами, отличающийся тем, что планшет с опытными и контрольными тестами последовательно помещают в фотографическую или сканирующую установку для получения оцифрованного изображения зон лизиса, далее обрабатывают каждое оцифрованное изображение с помощью адаптивного фильтра с получением оконтуренных отдельных зон лизиса различных размеров, а также слившихся зон лизиса, затем определяют среднюю суммарную площадь зон лизиса для опытных и контрольных образцов и при превышении величины средней суммарной площади зон лизиса в опыте над величиной средней суммарной площади зон лизиса в контроле не менее чем на 5% фагоиммунотест считают положительным.
| СКВОРЦОВ В.Т | |||
| и др | |||
| Скрининговый вироиммунитет для определения α и - γ-интерферона человека в биологических жидкостях | |||
| Иммунология, 1995, №2, с.26-28 | |||
| MAMAS S | |||
| et al, Viroimmunoenzymoassay for detection of antipenicilloyl antibodies and penicilloyl residues: comparison of results obtained by radio-, viro-and enzymoimmunoassay, Ann | |||
| Immunol | |||
| (Paris), 1979, 130C(3), p.407-418. |
