СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ Российский патент 1996 года по МПК C12N7/00 G01N33/535 

Изобретение относится к области биохимии вирусов, преимущественно иммунохимии вирусов, и может быть использовано в различных областях вирусологии, медицины, сельского хозяйства, ветеринарии, микробиологической промышленности, контроля окружающей среды, для высокочувствительного экспресс-анализа широкого круга вирусов.

Известны различные способы диагностики вирусных инфекций. Среди них - тесты на растениях и животных как индикаторах, электронная микроскопия, а также различные серологические методы капельная преципитация, иммунодиффузия в агаре, латексагглютинация [1] Каждый из этих методов при несомненных достоинствах отличается отдельными недостатками: неколичественностью определения, относительно низкой чувствительностью и специфичностью, трудоемкостью серийных определений. Методы иммунохимического анализа независимо от морфологии вирусных частиц обеспечивают высокую точность и специфичность определения аналита в сочетании с относительной простотой при рутинной диагностике многочисленных образцов [2]
Для проведения массовых анализов наиболее эффективным методом иммунодиагностики вирусов является иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на применении антител (или антигенов), меченных молекулой фермента [2]
Известен способ иммуноанализа вирусов, включающий стадию добавления в исследуемый образец антител, меченных ферментом, с последующим разделением компонентов иммунологической реакции путем последовательного добавления полиэлектролитов (полианиона и поликатиона) и определения исследуемого вируса по концентрации фермента-маркера в надосадке или перерастворенном осадке [3]
Недостатком известного способа является сложность процесса отделения очень малого количества осадка с использованием методов центрифугирования и фильтрации. Отсутствие соответствующего оборудования, позволяющего быстро проводить декантацию большого числа исследуемых образцов, делает метод длительным и трудоемким. Время анализа в данном случае лимитируется длительностью отделения осадка полиэлектролитного комплекса, его отмывкой и определением ферментативной активности в перерастворенном осадке. Кроме того, многостадийность метода осложняет возможность автоматизации проводимых измерений.

Задачей данного изобретения является разработка способа количественного определения вирусов, при котором существенно упрощается процесс разделения компонентов аналитической системы применительно к большим масштабам проводимых измерений.

Способ осуществляют следующим образом. К исследуемому образцу добавляют антитела, меченные ферментом. После протекания иммунохимической реакции в растворе его приводят в контакт с нерастворимым положительно заряженным носителем (полимером), вследствие чего компоненты, связанные с определяемым вирусом, адсорбируются на носителе в результате кооперативных электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными вирусными частицами, имеющими регулярную структуру, и положительно заряженной матрицей. После промывания носителя с целью удаления неспецифически связавшегося конъюгата антител с ферментом на него наносят раствор субстрата фермента и количественно измеряют концентрацию продукта. Эта величина пропорциональна концентрации определяемого вируса и служит характеристикой его содержания в исследуемом растворе. Концентрацию вируса в образце определяют с помощью калибровочного графика, полученного при использовании стандартных вирусных растворов. Если в качестве носителя выбирают положительно заряженную мембрану, а продукт ферментативной реакции является водонерастворимым и удерживается на мембране, то детекцию вируса можно проводить визуально.

В качестве положительно заряженных нерастворимых полимеров могут быть использованы пористые матрицы (например, нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, капроновые, нейлоновые, поливинилфторидные и другие синтетические мембраны), на которых предварительно был адсорбирован поликатион (например, поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид с линейной структурой и молекулярной массой от 40 до 2000 кДа, а также другие модифицированные поликатионы на основе поли-4-винилпиридина).

Детекция ферментативной активности может проводиться как непосредственно на матрице, так и в смывных растворах. Применение в первом случае субстратных систем, приводящих к образованию нерастворимого продукта, позволяет визуально оценить результаты анализа. Для детекции щелочной фосфатазы, например, могут быть использованы следующие субстратные системы, дающие водонерастворимый окрашенный продукт ферментативной реакции: альфа(бета)-нафтилфосфат и прочный голубой (Fast Blue); нафтол-AS-MX-фосфат и прочный красный (Fast Red); нитро-голубой тетразолий и 5-бром-4-хлориндолилфосфат и др. Для пероксидазы хрена наиболее распространенным субстратом является диаминобензидин в присутствии перекиси водорода и хлористого кобальта; для бета-галактозидазы чаще всего используют 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-Д-галактопиранозид в комбинации с солями тетразолия. Визуальная регистрация окраски поверхности пористого носителя в отраженном свете (а не на пропускание, как это имеет место при сравнении окраски жидких образцов в способе-прототипе) позволяет с большей точностью проводить сравнение получаемых образцов со стандартами. С другой стороны, обратимость ион-ионного взаимодействия при высоких значениях ионной силы позволяет многократно использовать нерастворимый положительно заряженный полимер, элюируя с него связавшиеся компоненты и измеряя ферментативную активность в элюате.

Пример 1. Анализ Х-вируса картофеля (ХВК).

В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к ХВК. Гамма-глобулиновую фракцию сыворотки крови выделяют двукратным осаждением в 20%-ном водном растворе полиэтиленгликоля (М.м. 6 кДа) с последующим диализом против 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М NaCl, pН 7,4).

В качестве фермента-маркера используют щелочную фосфатазу из кишечника теленка (1000-2500 IU/мг). Введение ферментной метки в молекулу антител проводят с помощью гетеробифункционального сшивающего агента - 3-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида. Ацилирование аминогрупп щелочной фосфатазы осуществляют по методике [4] Ацилированный фермент затем используют для конъюгации с частично восстановленными молекулами антител [4] При этом к 1 мг модифицированной щелочной фосфатазы в 2 мл 0,1 М трис-HCl (1 мМ MgCl₂; 0,1 мМ ZnCl₂; pН 7,0) добавляют 10 мг антител, содержащих активные SH-группы, в 2 мл 50 мМ Na-ацетатном буфере, pН 5,0. Далее реакционную смесь инкубируют 20 часов при +4^oC и постоянном перемешивании. После чего в нее добавляют 0,03 мл 0,1 М раствора 2-меркаптоэтаноламина и инкубируют при комнатной температуре 20 мин. Конъюгат выделяют на колонке (1,5•120) см с носителем-ультрагелем АсА-34, уравновешенным 10 мМ трис-HCl буфером (0,1 М NaCl; 1 мМ MgCl₂; 0,1 мМ ZnCl₂; 0,5 г/л NaN₃; pH 7,0). Фракции конъюгата хранят при +4^oC в присутствии 0,1% BSA.

В качестве антигена используют высокоочищенный вирусный препарат ХВК. Препаративное выделение очищенных экстрактов ХВК, его очистку и концентрирование проводят по стандартной методике, используя несколько циклов дифференциального центрифугирования [5]
Поли-N-этил-3-винилпиридиний бромид получают алкилированием поли-4-винилпиридина избытком бромистого этила при 60^oC в течение 30 часов с последующим осаждением в эфире. В работе используют поликатион с молекулярной массой 2000 кДа.

Растительный сок получают, растирая материал в фарфоровой ступке, с добавлением 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М NaCl; 0,1% тритон Х-100; pН 7,8) в соотношении 1:5 (растительная масса/объем буфера). Полученную смесь осветляют центрифугированием при 8000 об/мин 5 мин.

Нерастворимый заряженный полимер готовят следующим образом. Нитроцеллюлозные фильтры производства ВНИИМедполимеров инкубируют в 10^-7 М водном растворе поли-N-этил-4-винилпиридиний бромида с молекулярной массой 40 кДа в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем фильтры отмывают водой и высушивают при комнатной температуре.

В серию инкубационных пробирок, содержащих 0,1 мл исследуемого образца (растительный сок или очищенный препарат ХВК), добавляют 0,1 мл раствора меченных ферментом антител (10^-9 М), инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Разделение компонентов аналитической смеси проводят, пропуская ее через нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованным поликатионом. Детекцию ферментной метки на фильтре осуществляют визуально после инкубации его в растворе субстратов, содержащем Fast Blue RR (2 мг/мл) и альфа-нафтилфосфат (2,5 мг/мл) в 0,1 М трис-HCl буфере, pН 9,2. Чувствительность метода составляет 5-10 нг/мл ХВК. Время анализа не превышает 20-30 мин. Метод дает возможность определять ХВК в проростках и листьях растений на различных стадиях вегетации, а также осуществлять контроль растений, оздоровленных методом культуры меристем. Вследствие своей уникальной чувствительности и простоты предложенный метод пригоден для решения многих научных и практических задач, например изучения динамики вирусной инфекции, контроля степени очистки вирусов и т.д.

Пример 2. Анализ вируса табачной мозаики (ВТМ).

В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к ВТМ.

В качестве антигена используют высокоочищенный вирусный препарат ВТМ. Препаративную очистку ВТМ проводят по стандартной методике [6]
В анализе используют полидиметиламиноэтилметакрилат с молекулярной массой 100 кДа.

Нерастворимый заряженный полимер готовят следующим образом. Ацетилцеллюлозные фильтры производства ПО "Полимерсинтез", г. Владимир, инкубируют в 10^-7 М водном растворе поли-N-этил-4-винилпиридиний бромида с молекулярной массой 100 кДа в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем фильтры отмывают водой и высушивают при комнатной температуре на фильтровальной бумаге.

Ферментативную активность метки детектируют на фильтре, инкубируя его в субстратной смеси: Fast Red (1 мг/мл), нафтил-AS-MX-фосфат (0,2 мг/мл) в 0,1 М трис-HCl буфере, pН 8,2.

Остальные растворы готовят по описанию в примере 1.

Анализ ВТМ проводят аналогично методу определения ХВК в примере 1. Чувствительность анализа составляет 5-10 нг/мл ВТМ, время анализа 30 мин.

Пример 3. Анализ У-вируса картофеля (УВК).

Выделение очищенного препарата УВК проводят по методу [7] В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к УВК.

В качестве контроля при тестировании УВК в очищенных препаратах используют очищенные гетерологичные вирусы ХВК и ВТМ. При анализе растительного материала, зараженного УВК, контролем служат листья и клубни здоровых растений картофеля.

В анализе используют поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид с молекулярной массой 500 кДа.

Нерастворимый заряженный полимер готовят следующим образом. Капроновые фильтры, изготовленные по технологии ВНИИМедполимеров, инкубируют в 10^-7 М водном растворе поли-N-этил-4-винилпиридиний бромида с молекулярной массой 500 кДа в течение 10 мин при комнатной температуре.

Ферментативную активность метки детектируют на фильтре, инкубируя его в субстратной смеси: нитро-голубой тетразолий (0,33 мг/мл) и 5-бром-4-хлориндолилфосфат (0,17 мг/мл) в 0,33% N,N-диметилформамидном буфере, pН 9,5.

Остальные растворы готовят по описанию в примере 1.

Анализ УВК проводят аналогично методу определения ХВК в примере 1. Чувствительность анализа 10 нг/мл УВК, время анализа не превышает 30 мин.

Пример 4. Анализ вируса мозаики нарцисса (ВМН).

Выделение очищенного препарата ВМН проводят по методу [8] В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к ВМН.

В анализе используют поликатион поли-N-этил-4-винил-пиридиний бромид с молекулярной массой 1000 кДа и найлоновые фильтры производства Эксперим. лаб Р/К Хийу Калур, г. Таллинн. Мембраны инкубируют в 10^-7 М водном растворе поликатиона в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем фильтры промывают водой и высушивают при комнатной температуре.

Приготовление остальных растворов и реагентов для анализа ВМН, а также проведение анализа осуществляют согласно примеру 1.

Чувствительность метода 10 нг/мл ВМН, время анализа не превышает 30 мин.

Предлагаемый способ количественного определения вирусов является универсальным для анализа отрицательно заряженных вирусных частиц, независимо от их морфологии, биологических и физико-химических свойств. Так, например, ХВК относится к группе потексвирусов (размеры вирионов ХВК 515•15 нм, молекулярный вес вирионной РНК немного более 2 млн дальтон), в то время как УВК относится к группе потивирусов (размеры вирионов УВК 730•11 нм, молекулярный вес вирионной РНК 3 млн дальтон). Метод позволяет определять крупные палочковидные вирусы (ВТМ) и нитевидные (ВМН), которые невозможно идентифицировать методом иммунодиффузии в агаре. Кроме того, данный метод является специфичным и избирательным. Наличие других вирусов наряду с исследуемым не мешает анализу. Общая продолжительность анализа не превышает 30 мин, что в 6 раз меньше длительности известных твердофазных методов ИФА, в 60 раз меньше времени метода радиальной иммунодиффузии (метода, широко используемого в биохимической практике) и сопоставимо с длительностью проведения анализа по прототипу (30 мин) [3] Предложенный способ иммунохимического анализа вирусов сопоставим по своей чувствительности с известными твердофазными методами и с определением вирусов по прототипу. Высокая чувствительность предлагаемого метода позволяет проводить детекцию ХВК в клубнях, где концентрация вируса настолько мала, что исключается возможность применения капельного теста (который используется при определении ХВК только в листьях больного растения).

Таким образом, высокая чувствительность представленного метода позволяет исключить затраты, связанные с выращиванием растений для индексации посевного материала. Метод позволяет анализировать 0,01-0,1 мл пробы, т.е. для индикации данным методом требуется небольшое количество исследуемого материала, что особенно важно для селекционных работ. Кроме свежего материала, для анализа пригодны замороженные и высушенные образцы.

Высокая скорость, низкая стоимость, простота, универсальность разделения компонентов аналитической системы делают предложенный способ экспресс-анализа в целом практичным и эффективным.

ЛИТЕРАТУРА
1. Николаева О.В. Современные иммунологические методы в массовой диагностике вирусов растений. М. 1986, с. 1-53; ВАСХНИЛ-ВНИИТЭИСХ.

2. Voller A. Barlett A. Bidwell D. et al. The detection of Viruses by enzyme-linked immunosorbent assay //J. Genet. virol. 1976, v. 33, N 1, p. 165-167.

3. Авторское свидетельство СССР N 1343319, БИ N 37, 1987.

4. J. of Immunoassay, 1983, v.4, N 3, p. 209-327. Ed.E.Ishikawa Enzyme-labeling of antibodies.

5. Куст С. В. Добров Е.Н. Тихоненко Т.И. Исследование структуры РНК в частицах Х-вируса картофеля //Мол. биология, 1972, N 1, т. 6, с. 42-50.

6. Fraenhel-Conrot H. The role of nucleic acid in the reconstitution of active tobacco mosoic virus //J. Amer. Chem. Soc. 1956, v. 78, p. 882-886.

7. Новиков В.К. Атабеков И.Г. Агур М.О. и др. Метод получения препарата У-вируса картофеля и приготовления диагностических антисывороток //Сельскохоз. биология, 1982, т. 17, N 5, с. 706-711.

8. Baneroff I.B. Abonhaidor M. Erickson J.W. Purification and properties of clever yellow mosoic virus //Virology, 1979, v. 98, N 1, p. 121-130.

Использование: вирусология. Сущность изобретения: представляет собой способ количественного определения вирусов, который заключается в образовании комплекса исследуемого вируса со специфическими антителами, меченными ферментом, разделении компонентов иммунохимической реакции и применении полиэлектролитов с последующими стадиями добавления субстрата фермента и регистрации концентрации исследуемого вируса по концентрации фермента.

Способ количественного определения вирусов, предусматривающий образование комплекса исследуемого вируса со специфическими антителами, меченными ферментом, разделение компонентов иммунохимической реакции с применением полиэлектролитов с последующим добавлением субстрата фермента и регистрацией концентрации исследуемого вируса по концентрации фермента, отличающийся тем, что полизлектролит нанесен на подложку из полимерного синтетического материала, в качестве полиэлектролита используют ароматические поликатионы - производные поли-4-винилпиридина и алифатические поликатионы - полидиметилдиаллиламмоний хлорид и полидиметиламиноэтилметакрилат с линейной структурой и мол. м. 40-2000 кДа, а в качестве субстрата используют вещества, дающие в результате ферментативной реакции нерастворимый окрашенный продукт.