Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, может быть использовано в производстве препаратов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и лесных насаждений и представляет собой новый штамм спорообразующих бактерий.
Целью изобретения является получение нового штамма Вас,thuringiensis subsp.kurstaki, обладающего инсектицидной активностью против предглатшмнш отрядов Lepldoptera и Coleoptera.
Штамм получен путем скрещивании штамма Bac.thuringiensis subspkurstakl HD- 1 Dipel со штаммом Вас.thu ring lensis subsp.tenebrionis при совместном культивировании. Полученный штамм обладает инсектицидной активностью против колорадского жука (отр.Coleoptera) и представителей отряда Lepidoptera. Штамм Bac.Thirrlngiensis subsp.kurstaki Т - 2 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института ВНИИ - генетика и имеет регистрационный номер ВКПМ - В - 4853.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Культу рал ьно-морфо логические признаки, Грамположительные подвижные палочки размером 4,1 - 1,6 мкм. В стационарной фазе роста образуют кри- сталлы d-эндотоксинов и овальные споры, Хорошо растет на МП средах при 27 - 29°С ирН 6,8-7,5. НэМПАна 10-есутки при29°С образует однородные колонии 3-5 мм в , диаметре, светло-серого цвета со слабо из- резанным краем. Структура мелкозернистая.
В МПБ рост умеренный, помутнение однородное, образует кольцеобразную пленку.
На картофельном агаре и агаризован- ной среде Хоттингера рост обильный, на 7-е сутки при 29°С колонии светло-серого цвета, однородные, пигмента не образуют. По Н-антигену относится к сероварианту III (ЗаЗв).
Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода: усваивает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку. Не усваивает лактозу, ксилозу, арабинозу, лецитин. Пеп- тонизирует молоко, гидролизует крахмал, желатин не разжижает.
Отношение к. источникам азота: восста- навливает нитраты, усваивает аммонийные формы азота,
Отношение к температуре: хорошо растет при 27 - 29°С. оптимальная температура 28°С.
Отношение к рН среды: хорошо растет при 6,8 - 7,5, оптимум рН 7,2.
Отношение к кислороду: аэроб.
Отношение к фагам: устойчив к основным производственным фагам 11, 22, С/П, И-77, 25- 16.
Энтомопатогеннме свойства: синтезирует -эндотоксины, обладающие инсектицидной активностью против представителей отряда Lepldoptera и Coleoptera, синтезирует кристаллы d-эндотоксинов трех типов1 большой (1,1x0,7 мкм) и маленький (0,5 - 0,3 мкм) ромбы, плоский квадрат (размер стороны 1,1 мкм).
Генетические особенности: рекомби- нантный штамм Bac.thuringiensis subsp.kurstaki Т - 2 наряду с плазмидами, свойственными штамму Bac.thuringiensis subsp.kurstaki HD - 1 Dipel (реципиент), посредством трансцепции приобретает плазмидную ДНК штамма Bac.thuringiensis subsp.tenebrionsis (донор) размером т.п.н. Плазмида стабильна на протяжении более чем 100 генераций клеток. Стабильность штамма Т - 2 проверяют со - гласно следующей схеме. Штамм снимают петлей с агаризованной Nutrient Broth (NB) и вносят в 2 мл аналогичной питательной среды, после чего выращивают в течение 12 ч при28°С на круговой качалке при 240 - 260 об./мин. Затем 1 мл микробной культуры засевают в колбу емкостью 750 мл с объемом среды выращивания 100 мл Nutrient Broth. По окончании 4-часового интервала 1/2 часть культуры отбирают и добавляют равный объем свежей NB-срсды. Образцы отбирают для исследования куль- туральных признаков, иммунологического анализа и выделения плазмидной ДНК. Осуществляют 10 таких переносов, что составляет, согласно подсчетам, более 200 генераций клеток. Отобранные образцы разводят и высевают на чашки Петри с агаризованной средой Хоттингера с расчетом 30 - 100 колоний на чашку, после чего инкубируют при 28°С в течение 7-10 сут до полной споруляции анализированных клонов. Анализ плазмидного профиля, культу- рально-морфологических признаков, иммунологических свойств не выявил нестабильные варианты.
Предлагаемый рекомбинантный штамм Т - 2 генетически стабилен.
Маркерные признаки: Н-антиген ЗаЗв, плазмида размером 60 т.п.н., штамм обладает инсектицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera и Coleoptera и образует три типа кристаллов (5-эндотоксинов (большой и маленький ромб, плоский квэдоаг), / -эндотоксин не синтезирует.
Штамм хранят в ампулах после липфи- лизации спорокристэл лической смеси обычным способом или в згаризовэнной МПБ (0,2 - 0.4%) при 4ПС.
Пример 1. Родительские штаммы Bac.thuringiensis sut,p kui staki HD - 1
Dipel (реципиент, далее обозначается как KUR) и Bac.thurlnglensls subsp. tenebrlonsis (донор, далее обозначается как TEN), а также предлагаемый новый рекомбинантный штамм Bac.thurigiensls subsp.kurstaki T - 2 (далее обозначается как Т - 2) для подготовки посевного материала выращивают в 2 мл МПБ в течение 12 ч при 28°С на-круговой качалке при 240 - 260 об./мин. Затем 1 мл микробной культуры засевают в колбы емкостью 750 мл с обьемом среды выращивания 50 мл дрожже-полисахаридной среды (ДПС) следующего состава, г/л: дрожжи кормовые 36; кукурузная мука 26,8; соевая мука 5,0; мел 3,0; вода - остальное, рН среды 7,2, и культивируют на круговой качалке 48 ч до стадии полной споруляции в тех же условиях. Определение титра жизнеспособных спор проводят на чашках Петри с МПа.
Результаты исследований приведены в табл.1.
Данные сравнительного анализа, проведенного в лабораторных условиях, показывают, что продуктивность штамма Т-2 не уступает продуктивности исходных родительских штаммов и составляет 4,6x10 спор/мл.
П р и м е р 2. Иммунологический анализ (5-эндотоксинов родительских штаммов KUR и TEN и сконструированного штамма Т - 2 проводят в реакции двойной иммунодиффу- зии по Оухтерлони.
Для этих целей исследуемые штаммы выращивают на питательной среде (Dlfco, США) в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 75 мл. Подготовку посевного материала и культивирование проводят, как в примере 1. После выращивания исследуемых штаммов до стадии полной споруляции споры и кристаллы осаждают центрифугированием при скорости 6000 об./мин 15 мин, трижды промывают дистиллированной водой и гомогенизируют в 80 мл буфера (0,005 М трис-HCl, рН 8,0, с 0,5% . твин - 80) 5 мин при скорости 5000 об./мин. Затем 20 мл суспензии наслаивают на поверхность 20 мл 67%-ного раствора верог- рафина в пробирках емкостью 50 мл к ротору JS - 20 (Beckman, США) и центрифугируют 90 мин при скорости 10000 об./мин и 4°С. Фракцию кристаллов, локализованную на границе интерфаз вода - верографин, отбирают с помощью пастеровской пипетки и отмывают от остатка ве- рографина центрифугированием против дистиллированной воды трижды при 6000 об./мин в течение 10 мин. Очищенные кристаллы (более 96% чистоты) растворяют в 50 мл 0,05 М NaOH, рН 12,5и37°Свтечение
1ч. Количество полученного сЗ-эндотоксина оценивают спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Далее растворы кристаллов используют для иммунологического анализа с иммуноглобулинами кролика про5 тив (5-эндотоксинов родительских штаммов KUR и TEN в реакции Оухтерлони. Результаты исследований представлены в табл.2.
Как показывают приведенные в табл.2 данные, (5-эндотоксины исходных родитель0 ских штаммов резко отличаются между собой по своим иммунологическим свойствам, в то время как рекомбинантный штамм Т 2синтезирует кристаллические белки, им- мунологически идентичные и штамму-доно5 ру, и шгэмму-реципиенту.
Появление дополнительного (5-эндоток- сина штамма Т - 2 коррелирует с появлением плазмидной ДНК размером 60 т.п.н., присутствие которой наблюдали в плазмид0 ном профиле после анализа плазмидной ДНК исследуемых штаммов с помощью электрофореза в 0,6%-ном агарозном геле. Анализ и выделение плазмидной ДНК проводят с помощью метода Birnboim.
5Суммарная продукция (5-эндотоксиноо у
штамма Т - 2 не отличается от продукции на- указанной среде выращивания от исходных родительских штаммов и составляет 0,3 мг/мл.
0 Долю эндотоксинов, специфичных для Lepidoptera и Coleoptera, определяют с помощью SDS-электрофореза в 7% ПААГ по методу Weber и Osborn. Для этих целей штаммы подращивают и получают растворы
5 эндотоксинов, как в примере 2,
Результаты электрофоретического анализа приведены в табл.3.
Белки с молекулярной массой 133,130 и 65 кДа обладают инсектицидной активно0 стью против представителей отряда Lepidoptera. По данным электрофореза эга группа белков составляет примерно 70% от общего количества белков эндотоксинов ре- комбинантного штамма Т - 2. Остальная до5 ля общего белка приходится на эндотоксин с мол. массой 70 кДа. обладающий инсектицидной активностью против колорадского жука.
В полях зрения электронного микроско0 па обнаружено у штамма Т - 2 три типа кристаллов. Два из них свойственны штамму KUR (большой и маленький ромб), а третий тип кристаллического включения (плоский квадрат) свойствен штамму TEN.
5 П р и м е р 3. Определение энтомоцид- ной активности 5-эндотоксинов сконструированного и родительских штаммов проводят на личинках непарного шелкопряда (Llmantrla dlspar), используемого в качестве тест-объекта энтомоцидных свойств средств защиты растений, а также на личинках колорадского жука (Leptinotarsa decemllneata Say) - основного вредителя семейства пасленовых и представителя отряда Coleoptera.
Штаммы выращивают до стадии полной споруляции, как в примере 2. Используют гусениц непарного шелкопряда 2-3 возрастов. Тест-насекомых содержат в чашках Петри при 25 - 28°С и влажности 70 - 90%, фотопериод 18 ч. В каждом опыте используют 45 гусениц. Гусеницам дают возможность свободно поглощать инфицированный искусственный корм (3 г на чашку). Учет гибели гусениц проводят на б-е сутки. Биотестирование на личинках колорадского жука проводят по следующей схеме. Личинки 1 - 2 возраста помещают в чашки Петри на лист картофеля. Листовые пластинки обрабатывают суспензией спор и кристаллов исслег дуемых штаммов до полного смачивания, в контроле обрабатывают дистиллированной водой. После подсыхания листовые пластинки (размеры 4-7 см) помещают в чашки Петри с 10 личинками. Учет гибели личинок колорадского жука проводят на 3-е сутки. Число испытуемых концентраций препаратов должно быть не менее 5, количество опытов менее 4 с 3 повторностями в каждом.
В табл.4 представлены летальные концентрации препаратов, вызывающие 100%- ную гибель насекомых (на 1 г корма для непарного шелкопряда и 1 см2 листа растения для колорадского жука).
Сравнительные данные инсектицидной активности штаммов показывают, что ре- комбинантный штамм Т - 2 обладает совмещенным действием на представителей Le- pldoptera и Coleoptera в дозах, сравнимых с исходными родительскими штаммами.
Штамм Т - 2 эффективен против других видов насекомых в концентрации 10 спор/мл. На 4-е сутки наблюдается 100%-ная гибель у следующих личинок насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур: озимая совка (Ag rot Is segetum),
хлопковая совка (Hellothis armlgera). капустная совка (Mamestra brassical), отличная совка (Mamestra suasa), люцерновая совка (Hellothis vlrlplaca), донниковая совка
(Hellothis marltlma), луговой мотылек (Loxostege stlctialis).
Штамм Т - 2 не обладает инсектицидной . активностью в указанной испытуемой дозе против хищного клопа Podlsus macullventrls,
который используется как биологическое средство подавления численности личинок колорадского жука (Leptinotarsa decem- lineata Say). Следовательно, микробиологические препараты на основе штамма Т - 2
можно использовать в интегрированной системе защиты растений от колорадского жука совместно с биологическими средствами защиты растений, в частности совместно с хищным клопом для борьбы с колорадским
жуком.
Таким образом, методом трансцепции осуществлена передача плазмиды размером 60 т.п.н. из штамма-донора TEN в ре- ципиентный штамм KUR. Передача
плазмиды коррелирует с появлением кристаллического включения (форма - плоский квадрат) белковой природы в штамме реципиента KUR. Молекулярная масса этого белка примерно 70 кДа (определено
электрофорезом в 7% ПААГ в присутствии ДС-натрия). По своим иммунологическим и инсектицидным свойствам этот белок соответствует кристаллическому белку штамма- донора TEN. Следовательно, получен
штамм Т- 2, который синтезирует d-эндоток- сины исходных родительских штаммов. Ре- комбинантный штамм Т - 2 является перспективным для использования в микробиологической промышленности с целью
создания препаратов, обладающих энтомо- цидной активностью одновременно против представителей отрядов Lepldoptera и Coleoptera.
Формула изобретения
Штамм бактерий Bacillus thurlnglensls subsp.kurstakl ВКПМ В -4853 для получения энтомопатогенного препарата против Lepldoptera и Coleoptera.
1688819
10 Таблица 1
Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, может быть использовано в производстве препаратов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и лесных насаждений и представляет собой новый штамм спорообразующих бактерий. Целью изобретения является получение нового штамма Bacillus thuringlensls sisbsp.kurstaki, обладающего инсектицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera и Coleoptera. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ВКПМ - 4853. Штамм создан методом трансфекции на основе Bacillus thuringlensls subsp.kurstaki HD - 1 Dlpel. Донором плэзмидной ДНК служил штамм Eacilius thuringiensis subsp.kurstaki. Полученный штамм B.thuTingiensis subsp.kurstaki продуцирует (5-эндотоксины, обладающие инсектицидной активностью против бабочек и жуков, вредителей сельскохозяйственных культур. Штамм продуцирует кристаллы (5-эндотоксина трех типов. На среде ДПС продуктивность штамма 4,6 10 спор/мл, токсинообразование на среде Difco 0,3 мг/мл. Для непарного шелкопряда летальная концентрация токсических компонентов препарата, вызывающая 100%-ную смертность, на 1 г корма равна 1,5 10 спор/мл и 8 мкг токсина/мл; для колорадского жука на 1 см2 листа картофеля - 2,5 10е спор/мл и 70 мкг токсина/мл. 4 табл. О 00 00 00 ЧЭ
Штамм Вас, thuringlensls
Титр жизнеспособны) b EE-JjSLsiLP Р/мп
Покэзана положительная (+} или отрицательная (-) реакция кристаллических белков с иммуноглобулинами против 3 эндотоксина KUR и б-эндотоксинз TEN.
Штамм
Kurstaki HD-1 DIpel
Т-2 Tenebrionis
KUR
4
Таблица 2
Таблица 3
Состав эндотоксинов (молекулярная масса. кДа)
133;130; 65
133;130;70,65
70
Таблица 4
| Патент США № 4797279, кл | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
