Способ получения билирубиноксидазы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/02 A61K38/44 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения фермента билирубиноксидазы, катализирующего окисление желчного пигмента - билирубина.

Известен способ получения билирубиноксидазы аэробной ферментацией штаммов грибов Trachyderma tsunodae кл. Basidiomyces на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, при рН 8-9 и 28-45°С в течение 72-96 ч с последующей очисткой культуральной жидкости хроматографией на ионообменных смолах и афинной хроматографией 1.

Недостатком способа является его длительность (около 6 сут), а также то обстоятельство, что получаемый фермент расщепляет не более 60% билирубина, что не позволяет гарантировать точность результатов количественного определения небелкового азота и других компонентов в крови и моче.

Известен способ получения билирубиноксидазы путем гомогенизации сырья - плодов высших растений семейств пасленовых и банановых, преимущественно бананов или баклажанов, в водной среде-с последующей фильтрацией гомогената, осаждением фильтрата ацетоном, дополнительным растворением осадка в воде, переО

ю

Сл

е

00

осаждением из 70%-ного водного спирта и высушиванием целевого продукта 2.

Недостатки известного способа заключаются в необходимости использования пищевого сырья, низком выходе фермента (0,08-0,1% от исходной массы сырья), невысокой его способности расщеплять билирубин (60-65% от содержания в анализируемой пробе) даже при высоких концентрациях (0,15-0,3 мг/мл) и низкой стабильности били- рубиноксидазы при хранении (не более 20 сут при 4°С).

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения билирубиноксида- зы из гомогената кишечника крыс, основанный на экстракции фермента водой с последующей очисткой фракционированием минеральными солями и органическими растворителями 3.

Недостаток способа заключается в низкой активности фермента, выражающейся в его способности расщеплять лишь 40-50% билирубина, содержащегося в физиологических жидкостях организма, а также в нестойкости билирубиноксидазы (сохранение активности в течение 1-2 нед. в порошкообразном состоянии и в течение 2-4 ч в водном растворе).

Целью изобретения является увеличение выхода фермента, повышение его качества и стабильности.

Способ получения билирубиноксидазы предусматривает гомогенизацию сырья в водной среде, фильтрацию гомогената, обработку фильтрата ацетоном, дополнительное растворение осадка в воде и сушку, при этом в качестве сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, гомогенизацию проводят в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04% от массы сырья, осаждение ацетоном проводят трижды при 0°С, после растворения осадка в воде полученный раствор обрабатывают равным объемом 6-8 М водного раствора NaCI при 4-6°С в течение 10-12 ч с последующим диализом раствора против воды, а после сушки целевой продукт смешивают с глицином в количестве 0,1-0,2% от массы целевого продукта.

Пример 1.1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г индуктора - эфедрина (0,02% от массы сырья), смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют; фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0°С (3 объема от массы сырья), перемешивают, выдерживают при 0°С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды, раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0°С, через 4 ч осадок отделяют, операцию повторяют еще один раз, осадок растворяют в 1 л воды (отношение массы исходного сырья и воды 1:1), фильтруют, к

фил ьтрату доба вл я ют ра в н ы и о бъем 6 М водного раствора NaCI и смесь выдерживают .при40С 10ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуют против воды при 4°С 16ч, диализат сушат

сублимацией и получают 8 г порошка билирубиноксидазы (выход 0,8% от исходной массы сырья), к которому добавляют 8 мг глицина (0,1 % от массы целевого продукта), При добавлении к образцу крови с высоким

5 содержанием билирубина (более 20 ммоль/л) фермента в концентрации 0,05 мг/мл происходит расщепление 85% билирубина. Билирубиноксидаза сохраняет активность при 4°С в течение 2-4 мес.

0 П р и м е р 2. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,3 г индуктора - эфедрина (0,3% от массы сырья),

5 смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0°С ( 3 объема от массы сырья), перемешивают, выдерживают при 0°С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды,

0 раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0°С, через 4 ч осадок отделяют, операцию повторяют еще один раз, осадок растворяют в 1 л воды (отношение массы исходного сырья и воды 1:1), фильтруют, к

5 фильтрату добавляют равный объем М водного раствора NaCI, смесь выдерживают при 5°С 11ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуют против воды при 4°С 16ч, диализат сушат

0 сублимацией и получают 10 г порошка билирубиноксидазы (выход 1% от исходной массы сырья), к которому добавляют 15 мг глицина (0,15% от массы целевого продукта). При добавлении к образцу крови с высо5 «им содержанием билирубина (более 20 ммоль/л) фермента в концентрации 0,075 мг/мл происходит расщепление 90% билирубина. Билирубиноксидаза сохраняет активность при 4°С в течение 2-4 мес.

0 П р и м е р 3. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,4 г индуктора - эфедрина (0,04% от массы сырья),

5 смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0°С (3 объема от массы сырья), перемешивают, выдерживают при 0°С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды, раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0°С через 4 ч осадок отделяют, операцию повторяют еще раз, осадок растворяют в 1 л воды (отношение массы исходного сырья и воды 1:1), фильтруют, к фильтрату добавляют равный объему 8М водного рас- твора NaCI, смесь выдерживают при 6°С 12 ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуют против воды при 4°С 16 ч, диализат сушат сублимацией и получают 12 г порошка билирубиноксида- зы (выход 1,2% от исходной массы сырья), к которому добавляют 10 мл глицина (0,2% от массы целевого продукта). При добавлении к образцу крови с высоким содержанием билирубина (более 20 ммоль/л) фермента в концентрации 0,1 мг/мл происходит расщепление 95% билирубина. Билирубинок- сидаза сохраняет активность при 4°С в течение 2-4 мес.

При изменении данной совокупности признаков положительный эффект не достигается, что подается следующими сравнительными примерами.

Пример 4. 1кг печени свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г эфедрина, и далее поступают, как в примере 1. Получают 9 г порошка, не обладающего способностью расщеплять билирубин в образцах крови даже в концентрации 0,1 мг/мл.

Пример 5. 1 кг селезенки крупного рогатого скота измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г эфедрина, и далее поступают, как в примере 1. Получают 8 г порошка, при добавлении которого к образцу крови в концентрации 0,1 мл/мл не происходит расщепления билирубина.

Пример 6. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,1 г эфедрина (0,01% от массы сырья), и далее поступают, как в примере 1. Получают 0,7 г порошка билирубиноксидазы (выход 0,07% от массы исходного сырья), расщепляющей 55% билирубина в образцах крови при концентрации 0,15 мг/мл.

Пример 7. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды , в которой предварительно растворяют 0,2 г фенилаланина (0,02 % от массы сырья), и да- лее поступают, как в примере 1. Получают 1 г порошка билирубиноксидазы (выход 0,1 % от массы сырья), расщепляющей 65% билирубина в образцах крови при концентрации 0,2 мг/мл.

Пример 8. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой не растворяют индуктор, и далее поступают, как в примере 1. Получают 1 г порошка билирубиноксидазы (выход 0,1% от массы сырья), расщепляющей 60% билирубина в образцах крови при концентрации 0,3 мг/мл.

Пример 9. 1кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г эфедрина, смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0°С (3 обьема к массе сырья), перемешивают, выдерживают при 0°С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды, фильтруют, добавляют к фильтрату равный обьем 6 М водного раствора NaCI и смесь выдерживают при 4°С ч. Вследствие наличия значительного количества липидов в осадке, который не подвергался дополнительному обезжириванию, как в примере 1, при высаливании осадок не образуется, что не позволяет выделить билирубиноксидазу.

Пример 10. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что фильтрат, получаемый после фильтрации гомогената, обрабатывают этиловым спиртом. Получают 0,5 г порошка билирубиноксидазы (выход 0,05% от исходной массы сырья), расщепляющей 35% билирубина в образцах крови при концентрации 0,15 мг/мл.

Пример 11. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1,- за исключением того, что осадок после пе- ребсаждения из ацетона растворяют в воде и сушат сублимацией, минуя стадию диализа против воды. Получают 18 г порошка, не обладающего активностью билирубиноксидазы даже при концентрации 0,3 мг/мл в образцах крови.

Пример 12. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что к 8 г порошка билирубиноксидазы (выход 0,8% от массы сырья) добавляют 4 мг глицина (0,05% от массы порошка). При этом фермент сохраняет активность при 4°С в течение 15 сут.

Пример 13. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что к 8 г полученного порошка билирубиноксидазы (выход 0,8% от исходной массы сырья) не добавляют стабилизатор. При этом фермент сохраняет активность при 4°С в течение 8 сут.

Пример 14. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что к 8 г полученного порошка билирубиноксидазы (выход 0,8% от исходной массы сырья) добавляют в качестве стабилизатора 8 мг глюкозы (0,1% от массы порошка). При этом фермент сохраняет свою активность при 4°С в течение 14 сут.

Предлагаемый способ получения билирубиноксидазы по сравнению с известным способом позволяет повысить выход фермента в 16-24 раза, увеличить количество расщепляемого билирубина в крови на 30- 45% при концентрации фермента, добавляемого в кровь, в 10 раз меньшей, а также в 8,5 раз увеличить его стабильность нении в условиях низких температур.

Формула изобретения 1. Способ получения билирубиноксидазы, предусматривающий гомогенизацию кишечника млекопитающих в водной среде,

фильтрацию гомогената, высаливание с последующим растворением осадка в воде и сушку, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода фермента, повышение его качества и стабильности, в качестве

сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, гомогенизацию проводят в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04% от массы сырья, перед высаливанием проводят трехкратное

осаждение ацетоном, высаливание осуществляют 6-8 М водным раствором хлористого натрия при 4-6°С в течение 10-12 ч, а после растворения осадка проводят диализ против воды.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что после сушки целевой продукт смешивают с 0,1-0,2% глицина.

Изобретение относится к биотехноло гии, а именно к способу получения фермента билирубиноксидазы, катализирующего окисление желчного пигмента - билирубина. Для увеличения выхода фермента, повышения его качества и стабильности в качестве сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, которое гомогенизируют в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04% от массы сырья с последующим трехкратным осаждением ацетоном, высаливанием 6-8 М водным раствором хлористого натрия при 4-6°С в течение 10-12 ч и после растворения осадка диализом против воды. После сушки целевой продукт смешивают с 0,1 -0,2 % глицина. Выход целевого продукта 0,8-1,2% от массы сырья, что в 16-24 раза превышает выход фермента в известном способе, при этом количество расщепляемого билирубина в крови увеличивает на 30-45%, а стабильность фермента возрастает в 8,5 раз при хранении в условиях низких температур. 1 з.п. ф-лы.