Способ получения гликопептида Советский патент 1976 года по МПК A61K38/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПЕПТИДА

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может найти применение в медициие для лечения воспалительных заболеваний.

Способа получения гликопептида в патентной и доступной литературе не описано.

С целью получения гликопептида слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи и растирают в порошок, экстрагируют водой при 50-100°С в течение 10-45 мин при рН 1 -10, подкисляют уксусной кислотой, фильтруют, гидрализат обрабатывают ацетоном, разбавляют водой, высушенный и измельченный осадок подвергают энзнматическому протеолизу папаином или трипсином с последующей фильтрацией смеси и высушиванием.

Способ осуществляют следующим образом.

Слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи растирают в порошок, экстрагируют водой и нагревают при 50-100°С в течение 10-45 мин. Предпочитают проводить обработку при нагревании до температуры кипения, приближающейся к 100°С. Значение рН доводят до значений, которые могут находиться в пределах от 1 до 10 путем добавления кислот или щелочей. При рН выше 10 материал быстро разрушается. При значениях рН выше 9 ведут строгий контроль за температурой и временем нагревания. По окончании гидролиза осаждают все органические вещества, обладающие кислым характером, например серусодержащие мукополисахариды. Если гидролиз проводят при щелочной рН, смесь снова доводят до кислой рН путем добавления слабой кислоты, например уксусной, вызывая тем самым осаждение этих веществ. Фильтрат затем освобождают от протеиновых отбросов путем обработки энзимами, например параином, в условиях с подходящим рН. Перед энзиматической обработкой проводят предварительное

5 осаждение большинства протеиновых отбросов путем добавления подходящего реагента, например трихлоруксуспой кислоты. Разбавлением фильтратов органическими растворителями (спиртом или ацетоном) получают сырой гликонептид в виде белого или светлокоричневого порошка. Затем от сырого продукта удаляют примеси соляного характера. Очистку осуществляют при помощи диализа, либо пропусканием через ионообменные смолы кислотного или смешанного типа. Выход продукта после очистки достигает 65-75% по весу, а полученный продукт представляет собой бесцветный без запаха аморфный порошок. Содержание фосфора и серы в очищенном продукте очень ничтожны. Отсутствуют также урановые кислоты, гликопептиды являются одним из типов гликопротеинов, структура которых является результатом сочетания полисахаридпых и протеиновых мо-. лекул с преобладанием полисахаридной части. Гексозамины содержатся в количестве 40- 50%, аминокислоты 13-18%, гексозы 27- 317о и производные нейраминовых кислот 4-6%.

Фармакологические тесты на лабораторных животных показывают, что гликопентиды в дозах от 12,5, 25 или 50 мг/кг вызывают локальную здему карагенипом и серотонином, диффузию Blue Evansa во внутрикожную иолость серетопином, декстраном и брадихинином, а рост гранулемы, вызванной ватным шариком у крыс. При дозах 100 мг/кг гликопеитид уменьшает тяжесть язвенной болезни привратниковой части желудка и быстропротекаюш,их язв.

Пример 1. 10,2 кг глубоко замороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи размалывают в мясорубке. Материал суспендируют в 10 л воды и кипятят при перемешивании в течение 15 мин. В процессе этой обработки рП раствора поддерживают равным 9,2 путем повторных добавлений Зн. гидроокиси натрия. К концу этого нериода рН доводят до 4,7 добавлением 80%-ной уксусной кислоты (около 500 мл); смеси дают охладиться до 30°С, и после прибавления 10 л ацетона и 1 кг фильтруюшего веш,ества (целит, целатум и т. д.) фильтруют через ткань под действием силы тяжести. Таким путем получают 22 л фильтрата, которые зате.м разбавляют 55 л ацетона. Таким путем продукт осаждают, собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат нод вакуумом н измельчают. Вес полученного таким путем сухого порошка приблизительно равняется 3 кг.

Этот порошок диспергируют в 9 л воды,,.рП раствора доводят до 5,7 с помощью 2н. соляной кислоты, затем добавляют 20 г хлористого натрия и 20 г папаина, и после этого смесь нагревают при перемешивании до в течение 24 ч. Затем добавляют 50 г фильтрующего вещества и смесь профильтровывают через ткань под действием силы тяжести. Фильтрат концентрируют под уменьшенным давлением (50 мм рт. ст.) до объема 3 л и после этого обрабатывают 2,7 л ацетона. Полученный таким образом осадок, который собирался декантацией, промывают ацетоном и сушат под вакуумом.

Выход сырого гликопротеина приблизительно составляет 66 г.

Найдено, %: Р 3,63; S 0,21; N 5,91; ацетильные группы 7,21. Вязкость 1%-ного раствора при 20°С 1,2699 ср; рН 1%-ного раствора 6,9.

Пример 2. 3,8 кг глубокозамороженной желудочной слизистой оболочки свиньи размалывают в мясорубке. Материал суспендируют в 7,5 л воды и кипятят при перемешивании в течение 15 мин. В процессе этой обработки рН раствора поддерживают при значении 8,6 путем повторных добавлений 2 н. гидроокиси натрия. В конце этого периода сначала прибавляют 250 мл 80%-ной уксусной :ислоты, а затем некоторое количество трихлорацетоуксуспой кислоты (около 160 г), достаточное для доведения рН раствора до 1,8. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием и прозрачный фильтрат разбавляют ацетоном в количестве четырех объемов фильтрата. Осадок собирают фильтрованием, промывают ацетоном, сушат нод вакуумом и измельчают. Получают 47 г порошка,

который подвергают панаиновому протеолизу после доведения рН до 5,7 по методу, описанному в предыдущем примере. Получают сырой продукт, который весит 20 г. Найдено, %: Р 4; N 6,2.

Пример 3. 1 кг глубокозамороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи перемалывают на мясорубке. Материал суспендируют в 1 л воды, и после доведения рП до 4 прибавлением 80 %-ной уксусной

кислоты кипятят при перемешивании.

Смесь поддерживают при кипячении в течение 15 мин, затем ей дают охладиться и центрифугируют. Фильтрат обрабатывают 10 г ацетата натрия и затем разбавляют четырьмя

объемами ацетона. Осадок отделяют декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. 1аким путем получают 11 г порошка, которые подвергают папаиновой протеолитической обработке после доведения рП до 5,7, как описано в примере 1.

Сырой продукт, полученный по этой методике, весит 5,2 г. Найдено, %: Р 2,5; N 6,03. П Р и м е Р 4. 1 кг глубокозамороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки

свиньи размалывают на мясорубке. Материал суспендируют в 1 л воды, и после доведения рН до значения 1,7 добавлением трихлоруксусной кислоты нагревают до 50°С. Смесь поддерживают при этой температуре в течение

30 мин при перемешивании, и затем охлаждают и центрифугируют. Фильтрат обрабатывают 15 г ацетата натрия и затем разбавляют четырехкратным объемом ацетона. Осадок отделяют декантацией, промывают ацетоном,

сушат под вакуумом и измельчают. Таким путем получают 9 г порошка-, который подвергают нротеолитической обработке панаином после доведения рН до 5,7, как описано в примере 1.

Сырой нродукт, нолученный по этой методике, весит 4,8 г.

Найдено, %: Р 2,6; N 6,1. Пример 5. 100 г сырого гликопротеина, полученного по методике примера 1, суспендируют в 1 л воды. Суспензию с помощью центрифугирования освобождают от нерастворимой части и фильтрат обрабатывают 2н. гидроокисью натрия до значения рН 7,8. Полученный таким образом раствор подвергают

диализу с деионизированной водой при 20°С

через целлюлозную мембрану толщиной 0,03 мм в течение 48 ч. В конце этой обработки раствор достигает объема 2 л. Раствор концентрируют до первоначального объема 1000 мл под уменьшенным давлением 50 мм рт. ст., обрабатывают 5 г хлористого натрия и разбавляют 1200 мл ацетона или 2500 мл метанола. Образовавшийся осадок собирают декантацией, промывают растворителем, применявшимся для осаждения, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 69 г.

Продукт имеет следующие аналитические характеристики:

Найдено, %: S 0,25; N 5,81; Na 0,71; гексозамины 39,2; СНзСО 9,75.

Вязкость 1%-ного раствора при 20°С 1,6409 спуаз; рН 1%-ного раствора 6,3; урановых кислот нет; протеины содержатся в количестве 16,3% (фолин); гексозы 29,5%, производные нейраминовой кислоты 4,55%.

Пример 6. 100 г сырого гликонротеина, полученного по методике примера 1, суспендируют в 1 л воды. Суспензию освобождают от нерастворимой части путем центрифугирования и фильтрат обрабатывают 150 мл смолы «Амберлит JR 120 при комнатной температуре в течение получаса. Смолу затем промывают 100 мл дистиллированной воды и промывные воды объединяют с основным раствором. 5 г хлористого натрия добавляют и проводят осаждение из раствора путем разбавления 1320 мл ацетона. Образовавшийся осадок собирают декантацией и промывают 3 раза ацетоном, осадок затем вновь растворяют в 750 мл воды и рН раствора доводят до 6,2 с помощью обработки 2 н. NaOH. 3 г ацетата натрия добавляют в водный раствор, разбавляют 2,5 об. его раствора ацетоном, посредством чего получают осадок, который собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 67 г.

Найдено, %: Р 0,08; S 0,2; N 6,03; СНзСО 9,34; Na 0,43; гексозамины 39,5; урановых кислот нет; гексозы - 29,5; протеины (фолин) 14,0; производные нейраминовой кислоты 5,33.

рН 1%-ного раствора 6,2. Вязкость 1%-ного раствора при 20°С 1,9189 снуаз.

Пример 7. 100 г сырого гликопротеина, полученного но методике примера 1, суспендируют в 1 л воды. Суспензию освобождают от нерастворимой части с номощью центрифугирования и фильтрат обрабатывают 100 мл смолы «Амберлит JR 120. Через 30 мин после этой обработки смолу отделяют

фильтрованием и промывают 100 мл дистиллированной воды, промывные жидкости объединяют с фильтратом. Этот раствор обрабатывают 100 мл «Амберлита JR А 410 дополнительно в течение 30 мин. Смолу отделяют

фильтрованием и промывают 150 мл дистиллированной воды, промывные жидкости объединяют с фильтратом и рН доводят до 6,2 с помощью добавления 2н. NaOH. Добавляют 5 г ацетата натрия с последующим разбавлением равным объемом ацетона. Образовавщийся осадок собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 70 г. Найдено, %: Р 0,04; S 0,11; Na 0,27; ацетильные группы 0,93; N 5,74; гексозамины 40; урановых кислот нет; протеины (фолин) 14,5; гексозы 31; производные нейраминовой кислоты 5,20. рН 1%-ного раствора 6. Вязкость 1%-ного

раствора при 20°С 1,9004.

Формула изобретения

35

Способ получения гликонептида, отличающийся тем, что, слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи растирают в порошок, экстрагируют водой

при 50-100°С в течение 10-45 мин при рН 1 - 10, подкисляют уксусной кислотой, фильтруют, гидролизат обрабатывают ацетоном, разбавляют, водой, высушенный и измельченный осадок подвергают энзиматическому протеолпзу папаином или трипсином с последующей фильтрацией смеси и высущиванием.