Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый для получения моноклональных антител к пероксидазе хрена Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в им- муноферментном анализе.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моно- клональные антитела (МКА) к перокси- дазе хрена, которые обладают повышенПри наличии в испытуемой пробе антител против пероксидазы они соединяются с внесенным в пробу ферментом, образуя иммунные комплексы, и этим обуславливают фиксацию фермента на стафилококках, благодаря чему последние приобретают несвойственную им в норме пероксидазную активность. Фик

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в иммуноферментном анализе. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, пр-одуцирующего монокло- -нальные антитела (МКА) к пероксидазе хрена, которые обладают повьшенным сродством к стафилококковому белку А. Штамм получают гибридизацией сплено - цитов мьш1ей линии SIL/I, иммунизированных пероксидазой, с клетками миело- мы 653,А. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:00000, в ас- цитической - 1:000000. Ста бильная продукция антител сохраняется на протяжении 46 пассажей in vitro. МКА относятся к классу I gG 2 Ь,они за-- держиваются сорбентом, содержа1Ц11м S Стафилококковый белок А при рН 8,0, а элюируются с него при снижении рН до 3,5. Штамм онкогбнен для мьшей IF /SIL/IXBALB/C). сл

I ным сродством к стафилококковому бел- .« сацию выявляют путем проведения

15

.20

25

30

ку А,

Штамм получают следующим образом. - Для иммунизации мышей и выявления антител используют препарат пероксидазы хрена с показателем чистоты RZ 0,3. Препарат в дозе 0,2 мг в объеме 0,05 мл полного адьюванта Фрейнда вводят мьпаам линии SIL/I подкожно дву кратно с интервалом 6 недель. На седьмые сутки после второй иммунизации сыворотки животных исследуют на содержание антител против пероксидазы. Спустя еще три недели мышей, у которых титр антител в сыворотке составляет 1:2096, дополнительно иммунизируют внутрибрюшинно 0,2 мг пероксидазы в 0,5 мл физиологического раствора и через трое суток получен ные от них селезеночные клетки используют для гидридизации. Партнера- :ми для гидридизации служат клетки |миеломного штамма 653.А, выращенные на питательной среде, содержащей моди- |фицированную Дульбекко среду Игла |(90%) и сыворотку крупного рогатого I скота (10%). Для слияния используют Il0 клеток селезенки и 5x10 клеток 1миеломного штамма, смесь которых об- |рабатывают раствором гаолиэтиленглико- ля (50%) с молекулярной массой 1000. Дпя выращивания гибри ов используют фидерный слой из педитонеальных мак- Рофагов мЬшей и питательную среду :указанного состава, содержащую на И00 мл, мг: аминоптерин 10; гипоксан-. тин 500 и тимидин 500. Дополнительно среду обогащают 10% ростовой среды, в которой в течение пяти дней культивируют клетки штамма 653.А. С седьмого дня после гидридизации из состава среды исключают аминоптерин, ас 50 четырнадцатого гипоксантин и тимидин. Для вьшвления культур, содержащих гибридные клетки-проценты антител к пероксидазе, применяют тест, осно35

40

45

катализируемой пероксидазой реакции превращения бесцветного субстрата в окрашенное производное. Интенсивность окращивания зависит от концен рации антител и от прочности их свя зывания с ферментом и стафилококками. Выявляют 17 культур, вырабатыва щих антитела искомой специфичности Среди них для дальнейшей работы выбирают культуру, надосадочная жидкость которой дает наиболее яркое окрашивание при тестировании указан ным способом. Клетки этой культуры подвергают клонированию методом лим тирующих разведений на фидерном сло из перитонеальных макрофагов мышей. 98% полученных клонов позитивны при тестировании на выработку антител против пероксидазы. Один из получен ных клонов размножают до массовой кул-ьтуры и реклонируют, 100% выросших клонов продуцируют антитела к пероксидазе. Полученный штамм размн жают до массовой культуры, на 46-м пассаже с момента получения криокон серрируют и депонируют во Всесоюзно коллекции клеточных культур под ном ром 45Д Института цитологии АН СССР

Штамм характеризуется следующими признаками. ,

Морфологические признаки.

Клетки в культуре выглядят прозрачными, округлыми, часть их прилип ет к поверхности культуральных сосу дов. При ухудшении условий культиви рования клетки утрачивают однородность размеров и прозрачность, сред них появляются частицы детрита.

Кариологические признаки.

Карйотип клеток соответствует их видимой принадлежности: большинство хромосом имеет акроцентрическую кон фигурацию. Модальное число хромосом равно 92 (клетки родит ельского миел

ванньш на способности клеток золотис-55 много штамма имеют модальное число

того стафилококка связывать мьшшные иммуноглобулины класса 1 gG, не нарушая их взаимодействия с антигеном.

5

0

5

0

50

5

0

45

катализируемой пероксидазой реакции превращения бесцветного субстрата в окрашенное производное. Интенсивность окращивания зависит от концентрации антител и от прочности их связывания с ферментом и стафилококками. Выявляют 17 культур, вырабатывающих антитела искомой специфичности. Среди них для дальнейшей работы выбирают культуру, надосадочная жидкость которой дает наиболее яркое окрашивание при тестировании указанным способом. Клетки этой культуры подвергают клонированию методом лимитирующих разведений на фидерном слое из перитонеальных макрофагов мышей. 98% полученных клонов позитивны при тестировании на выработку антител против пероксидазы. Один из полученных клонов размножают до массовой кул-ьтуры и реклонируют, 100% выросших клонов продуцируют антитела к пероксидазе. Полученный штамм размножают до массовой культуры, на 46-м пассаже с момента получения криокон- серрируют и депонируют во Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером 45Д Института цитологии АН СССР.

Штамм характеризуется следующими признаками. ,

Морфологические признаки.

Клетки в культуре выглядят прозрачными, округлыми, часть их прилипает к поверхности культуральных сосудов. При ухудшении условий культивирования клетки утрачивают однородность размеров и прозрачность, среди них появляются частицы детрита.

Кариологические признаки.

Карйотип клеток соответствует их видимой принадлежности: большинство хромосом имеет акроцентрическую конфигурацию. Модальное число хромосом равно 92 (клетки родит ельского миело54). В клетках обнаруживаются 2-3- маркерные метацентрические хромосомы. Культуральные признаки.

Стандартные условия

культивирования штамма следующие: температура , воздушная атмосфера при выращивании клеток в герметично закрытых флаконах или атмосфера с 7,5% СО в воздухе со 100%-ной влажностью при выращивании в открытой системе. Питательной средой служит смесь среды Игла в оригинальной прописи или в модификации Дульбекко (90%) и сыворотки крупного рогатого скота (10%).

Культура представляет собой взвес одиночных клеток или рыхлых агрегатов по 4-16 и более клеток, легко разъединяющихся при встряхивании. Оптимальная посевная доза - 2x10 клеток в 1 мл среды. Для поддержания культуры в пролиферирующем состоянии клетки рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1:2 - 1:4. Максимальная плотность культуры с сохранением жизнеспособности - 1,4-1,6x10 кле- .ток в 1 мл. Для получения содержащей антитела асцитической жидкости мышам межлинейным гибридам, получившим за 7-15 дней до .прививки инъекцию 0,5мл пристана внутрибрюшинно, вводят тем же путем 5-10 млн клеток, выращенных в условиях культивирования. Асцит развивается в течение 2-А недель. Ег собирают, клетки опухоли отделяют от асцитической жидкости и перевивают новой группе мьш1ей, а жидкость используют как источник антител.

Продуктивность штамма.

ТиТр антител в культуральной жидкости составляет 1:00000, в асцитической - 1:000000. Стабильная про-, дукция антител сохраняется на протяжении 46 пассажей in vitro.

Характеристика полезного продукта

МКА относятся к классу I gG 2 Ь, они задерживаются сорбентом, содержа: щим стафилококковый белок А при ph 8,0 а злюируются с него при снижении ph до 3,5.

На иммуносорбенте, содержащем иммобилизованную пероксидазу хрена, МКА полностью задерживаются при рН 8,2. При элюировании глициновым буфером (рН 2,8) с сорбента смывается не более 30% сорбированных антител, что указывает на высокий аффинитет антител

к пероксндазе . В тесте встречной имму-

нодиффузии или при смешивании с 10- 50-кратным избытком антигена види44ых осадков не образуется, т.е. антитела

0

5

0

5

0

5

0

5

0

не относятся к разряду преципитирую- щих.

Контаминация.

Проверка штамма на присутствие контаминирующих микроорганизмов, проведенная на культурах, постоянно выращиваемых без антибиотиков, показала отсутствие бактерий, грибов, дрожжей и микоплазм.

Онкогенность.

Штамм онкогенен для мышей F (SIL/ IxBALB/c).

Криоконсервирование.

Криоконсервацию штамма проводят в среде следующего состава, %:

Среда Игла45

Сыворотка крупного

рогатого скота45

Диметилсульфоксид 10

Ампулы со взвесью клеток, содержа- .щей 1-5x10 кл/мл, помещают в пенопластовый контейнер с толпщной стенок 15 мм, и вьщерживают в нем при -80°С в течение 24 ч, затем ампулы переносят в жидкий азот.

Для размораживания клеток ампулы, извлеченные из жидкого азота, помещают на 4 мин в воду с температурой 42 С, центрифугируют при 1,000 об/мин 3 мин, заменяют кривозащитную среду на ростовую и рассеивают, разбавив взвесь до концентрации 3-5x10 кл/мл. Через 24 ч добавляют равный объем свежей ростовой среды и на следующий день рассеивают по 2x10 кл/мл.

Пример 1. Хроматографически очищенный иммуноглобулин мышей растворяют в 0,1 М бикарбонатном буфере с рН 9,5 и доводят концентрацию его до 5 мкг/мл. В лунки планшетов из поливинилхлорида вносят по 0,1 мп раствора и инкубируют 2 ч при 37 С и 18 ч при 4°С. Затем лунки трижды отмывают раствором, содержащим в ) 0,015 М фосфатном буфере, %: хлорид натрия 0,85, желатина 0,5 и твин-20 0,.1. В качестве стандарта используют аффинно-очищенные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мьш1и, растворенные в буфере указанного состава. Испытуемые сьшоротки кроликов вносят . по 0,1 мл в лунки планшетов и готовят ряды двукратных разведений на буфере, используемом для отмывки

планшетов.

ные лунки,

Стандарт вносят в отдель- Разведения испытуемых

сывороток и стандарт инкубируют в луйках 1 ч при 37 С и затем трижды

отмывают раствором указанного состава. Далее в лунки вносят раствор, содержащий моноклон,альные антитела против пероксйдазы (10 шсг/мл) и пероксидазу хрена (50 мкг/мл). После инкубации в течение 1 ч при 37 С лунки трижды OTMbiBaipT и BIHOCHT в них раствор хррмогенного субстрата. Через 30 мин оценивают результат реакции фотометрически. Оптическая плотность в лунках, содержащих стандарт, со- стайляет 0,550±0,050.

Пример 2. В качестве антигена используют лиофилизированный препарат легких цепей, вьщеленных из донорского иммуноглобулина человека путем восстановления, алкилирования и последующего отделения легких цепей гель-фильтрацией. Антиген растворяют в 0,1 М бикарбонатном буфере с рН 9,5, доводят его до концентрации 10 мкг/мл и вносят в лунки планшетов из поливинилхлорида. Условия сорбции антигена и отмьшания описаны в примере 1. Испытуемые сыворотки мышей вносят по 0,1 мп в лунки планшетов и готовят ряды разведений на отмывающем буфере. После инкубации в течение 1 ч при.37°С испытуемые пробы удаляют, лунки трижды отмывают, затем в них вносят раствор аффинно- очищенных кроличьих антител против иммуноглобулинов мьппи (10 мкг/мл), вновь инкубируют 1 ч при и трижды отмьшают. Далее в лунки вносят раствор, содержащий моноклональные антитела и пероксидазу, а после инкубации - хромогенный субстрат (концентрации реагенов такие же, как в

предьщущем примере). Окрашивание в лунках оценивают через 30 мин. Разведение мышиной сыворотки 1:800 обеспечивает развитие окраски с оптической плотностью 1,755.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (И) № 45 Д, используемый для получения моноклональных антител к пероксидазе хрена.