Способ определения активности фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

(Л

С

Изобретение относится к исследованиям биологических материалов, в частности к определению активности фактора, ингиби- рующего миграцию лейкоцитов крови, ч го может быть использовано в исследованиях состояния сенсибилизации Т-лимфоцктов к определенным антигенам с целью диагностики иммунопатологических заболеваний. Цель изобретения - упрощение способа за счет применения желатина для удержания клеток в малом объеме Для этого лейковз- весь осаждают в среде 199 с 1 %-ным желатином, осадок помещают в лунки планшета для иммунологических реакций, инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем 300 мин при 4°С, после чего добавляют исследуемую культуральную жидкость, инкубируют 18-24 ч при 37°С. измеряют зоны миграции и по их разнице в контроле и опыте судят об активности фактора, ингибирую- щего миграцию лейкоцитов.

Изобретение относится к исследованиям биологических материалов, в частности к определению фактора, ингибмрующего миграцию лейкоцитов.

Цель изобретения - упрощение предлагаемого способа - достигается осаждения лейковззеси в среде с 1 %-ным желатином с последующей инкубацией осадка в лунках иммунологического планшета в течение 30 мин при комнатной температуре (для оседания клеток на дно лунки),-а затем 30 мин при 4°С (для образования твердого геля, в котором сконцентрированы лейкоциты). После этого в лунки добавляют исследуемую культуральну.о среду и инкубируют планшет при не менее 18 ч, после чего измеряют зоны миграции клеток и рассчитывают активность фактора ичгибирующего миграцию лейкоцитов, по формуле

% ИМ --- 100(%), /л

где А - увеличение зоны миграции в контроле;

Б - увеличение зоны миграции в опыте (т.е. в присутствии исследуемой культураль- ной среды);

% ИМ - процент ингибиции миграции лейкоцитов.

Пример 1. Лейковзвесь, полученную путем расслаивания гепаринизированной крови трех доноров, отмывали средой 199, после третьей отмывки суспендировали в среде 199 с 5%-ной сывороткой крупного рогатого скота (СКРС) в концентрации 1 х х 106 кл/мл и культивировали в течение 1 ч при 37°С с фитогемагглютинином (ФГА) в разведении 1:1000 в объеме 2 мл. После культивирования клетки трижды отмывали средой 199 и культивировали в той же конЈ О

центрации еще 18 ч при 37°С в среде 199 с 5%-ной СКРС(опыт). Контрольные культуры проводили также, но без добавления ФГА. После культивирования забирали надоса- дочную жидкость, которую центрифугиро- вали при 300 об/мин в течение 10 мин для удаления остатков клеток, после чего тестировали на активность фактора ингибиции миграции.

К 4,5 мл гепаринизированной крови до- бавляли 0,5 мл 10%-ного раствора желатина, инкубировали 45 мин при 37°С лейко- взвесь дважды отмывали средой 199 и один раз средой 199 с 1%-ным желатином. Над- осадок сливали, остатки удаляли стериль- ным марлевым тампоном, осадок встряхивали и разносили по 2 мкл в центр углубления У-образных лунок планшета (Флоу, Шотландия). Планшет инкубировали 30 мин при комнатной температуре, 30 мин - при 4°С и добавляли по 0,1 мл среды 199 с 5%- ной СКРС. Затем, оставив в качестве контроля по две лунки от каждого донора, в остальные добавляли по 0,1 мл надосадоч- ной жидкости от тестируемых культур и Ф ГА в конечном разведении 1:5000. Планшет инкубировали 18 ч при 37°С во влажном воздухе с 5% С02, после чего измеряли диаметры зон миграции с помощью штангенциркуля.

Средние величины диаметров зон миграции (каждый из трех доноров крови тестировался на лейковзвеси от трех неродственных доноров) приведены в табл. 1.

Наименьшие зоны миграции получены в лунках с надосадочной жидкостью ФГА- стимулированных клеток, средний % ИМ составил 84% в опыте и 7% в контроле; % ингибиции миграции (% ИМ) рассчитывали по формуле

% ИМ хЮО{%),

г

где А - разность диаметра (средняя из двух лунок) зоны миграции в лунках с ФГА и без ФГА; Б -разность диаметра зон миграции в лунках с ФГА и надосадочной жидкостью и в лунках без ФГА.

Таким образом, надосадочная жидкость лейкоцитов, стимулированных ФГА, содержит фактор ингибиции миграции лейкоци- тов.

Пример 2. Из периферической крови здоровых доноров выделяли мононуклеар- ные клетки с помощью центрифугирования на растворе верографии-фиколл. после чего из мононуклеаров выделяли Т-клетки, образующие ранние розетки (рЕ-РОК) и восстановленные розетки (вЕ-РОК)с помощью осаждения соответствующих видов розеток на растворе верографин-фиколл(по известной методике). По 1 х 10б клеток (рЕ- и вЕ- РОК) инкубировали при 37°С в мл среды 199 с 10% АВ-сыворотки в присутствии фи- тогемагглютинина (ФГА-Р, Дифко США) в конечном разведении 1:1000 в течение 1 ч, трижды отмывали средой 199 и культивировали в концентрации 1 х 106 кл/мл в срэде 199 с 10% АВ-сывороткой в течение 18 ч.

После инкубации нздосадочные жидкости тестировали на активность фактора ин- гибииии миграции с помощью известного способа и предлагаемого способа.

Процент мнгибиции миграции, измеренный в одних и тех же образцах двумя способами, приведен в табл. 2.

Результаты показывают, что для культу- ральной жидкости как от рЕ-, так и от вЕ- РОК активность фактора, ингмбирующего миграцию, определяемая двумя способами, не отличается друг от друга.

Таким образом, предлагаемый способ более прост по сравнению с прототипом, так как в нем отпадает необходимость работы с капиллярами в стерильных условиях, однако он позволяет оценить продукцию фактора ингибирующего миграцию лейкоцитов с той же точностью.

Формула изобретения

Способ определения активности фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов, путем измерения зон миграции лейкоцитов при инкубации их с исследуемой культу- ральной средой при 37°С не менее 18 ч, о т- личающийся тем, что, с целью упрощения способа используют лейкоциты, выделенные а растворе 1%-ного желатина, которые до начала инкубации с культураль- ной средой помещают в лунки планшета для иммунологических реакций и инкубируют 30 мин при комнатной температуре, а затем 30 мин при 4°С.

Таблица 1

Продолжение табл. 1

Таблица 2