СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ СИНТЕЗ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Российский патент 1998 года по МПК A61K31/28 

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано в экспериментальных исследованиях при изучении механизма влияния биологически-активных веществ на иммунную систему организма, в частности на B-систему, а также в клинической практике в качестве лекарственного средства.

В настоящее время хорошо изучено влияние различных иммуномодуляторов химической и биологической природы (тактивин, миелопид, диуцифон и т.д.) на показатели иммунного статуса человека и лабораторных животных и многие препараты уже используются в клинической практике для лечения различных заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы.

Особое внимание, как к перспективным для практического применения, уделяется группе соединений германия, которые находят все более широкое использование в качестве средств с различным спектром биологической активности и низкой токсичностью.

Из этой группы биологически активных веществ выделяются герматраны, представители которой проявляют антиканцерогенную, антивирусную, нейротропную и т.д. активность [1].

Одним из представителей названной группы германийорганических соединений является 1-гидроксигерматран (моногидрат) (C₆H₁₅NO₅Ge), который является известным и для которого установлена противогипоксическая активность [2].

1-гидроксигерматран (моногидрат) (или герматранол) представляет собой белый кристаллический порошок, хорошо растворимый в воде, ДМСО, ДМФС. Молекулярная масса - 254,01. Отличается чрезвычайно низкой токсичностью. По разным определениям имеет ЛД₅₀ от 6000 до 10000 мг/кг живой массы.

Задачей изобретения явилось изыскание среди известных германийорганических соединений соединения, оказывающего стимулирующее влияние на B-систему иммунитета и его применение с этой активностью.

Поставленная задача решена с помощью известного соединения - 1-гидроксигерматрана (моногидрата) (герматранола), у которого в результате всестороннего экспериментального изучения выявлено стимулирующее действие на синтез иммуноглобулина, в частности IgA, IgM, IgG.

Кумулятивным тестом для оценки B-системы иммунитета является изучение способности B-лимфоцитов выполнять свою основную функцию: синтезировать иммуноглобулины IgA, IgM, IgG. Для этого индуцируется синтез иммуноглобулинов in vitro с помощью T-B-митогена-митогена-лаконоса (PWM).

Авторами данной заявки изучалось влияние препарата герматранола (Ge) на основные параметры иммунной системы: функциональную активность фагоцитов, T- и B-лимфоцитов.

В соответствии с поставленной задачей изучено влияние герматранола на следующие показатели иммунитета:
1. пролиферативный ответ лимфоцитов на T-митоген: фитогемагглютинин (ФГА);
2. синтез иммуноглобулинов in vitro;
3. фагоцитирующая активность клеток периферической крови;
4. люминолзависимый хемолюминесцентный ответ фагоцитирующих клеток;
1. Пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА.

Забор крови осуществляли в утренние часы натощак. Использовали гепаринизированную (20 ед/мл) кровь, взятую из локтевой вены. Мононуклеарные клетки (МК) выделялись с помощью одноступенчатого градиента плотности Ficoll-Paque ("Pharmacia"). Жизнеспособность клеток после выделения составляла 98-99% (по методу окраски 0,1%-ным раствором трипанового синего "Serva"). МК в полной культуральной среде (ПКС):(RPMI-1640 с добавлением 101)% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 10 мМ HEPES-буфера (все "Flow"), 2 мМ L-глутамина (Институт Полиомиелита и Вирусных Энцефалитов АМН (РФ) и 40 мкг/мл гентамицина ("Pharmachim", Болгария) в концентрации 2 млн/мл.

Мононуклеарные клетки разносили в 96-луночных круглодонный планшет ("Linbro") по 100 тысяч на лунку по триплетам. К 1-му триплету добавляли только ПКС, ко 2-му - ФГА (60 мкг/мл "Serva"). Эти триплеты использовали как контрольные. К 3-му, 4-му, 5-му и 6-му триплетам соответственно добавляли герматранол в конечной концентрации 50, 5, 0,5 и 0,05 мкг на весь период инкубации, т.е. 72 ч. Клетки инкубировались в CO₂ - инкубаторе. Конечный объем каждой лунки - 150 мкл. Уровни пролиферативных ответов оценивали радиометрически по включению 3H-тимидина (1 мкК/лунку) вносимого за 6 ч. до окончания инкубации. Данные по триплетам усредняли. Оценивали число излучаемых импульсов в минуту (имп/мин), индексы стимуляции (ИС) как отношение индуцированной пролиферации к спонтанной.

2. Синтез иммуноглобулинов in vitro.

Функциональное состояние иммуноцитов оценивали по способности МНК синтезировать Ig при длительном культивировании. Данный метод позволяет оценить состояние B-клеток, трансформирующихся в плазматические Ig-синтезирующие клетки, Т-хелперов, передающих на B-клетки активирующий сигнал и в меньшей степени T-супрессоров, контролирующих механизмы активации.

Для оценки способности B-клеток синтезировать Ig к 150 тысячам отвечающих клеток добавляли герматранол в концентрации 50, 5, 0,5 и 0,05 мкг соответственно. Для оценки способности синтезировать Ig клетки в той же концентрации инкубировали с PWM в дозе 125 мкг/мл ("Sigma"). Клетки культивировали 10 дней в CO₂ - инкубаторе ("Flow") при 37^oC в круглодонных планшетах ("Linbro"). По окончании культивирования планшеты центрифугировали (10 мин, 400 g) и в супернатантах иммуноферментным методом определяли содержание IgA, IgG и IgM (в нг/мл). Для этого антиизотипические козьи антитела против IgA, IgG, и IgM (10 мкг/мл, "Sigma") в фосфатном буфере (pH - 7,4) вносили в лунки 96-луночных плоскодонных планшетов ("Greiner") и оставляли на 18 ч. при 4^oC. После четырехкратной отмывки фосфатным буфером в лунки по триплетам вносили исследуемые образцы и стандартную сыворотку (с 2 мкг/мл шагом "2" до 1,9 нг/мл) и инкубировали 60 мин при 37^oC в фосфатном буфере с твин-20 (0,05%). После четырехкратной отмывки в лунки вносили конъюгат козьих антител против Ig человека меченных пероксидазой хрена ("Sigma") в разведении 1: 1000 и оставляли на 60 мин при 37^oC. Затем в лунки вносили субстратную смесь (0,15 М фосфатноцитратный буфер, pH=5,0 с 0,04% ортофениленамина и 0,012% перекиси водорода) по 100 мкл/лунку и оставляли при комнатной температуре на 30 мин. Субстрат-ферментную реакцию останавливали добавлением 2 N серной кислоты по 50 мкл/лунку. Концентрацию Ig в стандартных растворах и исследуемых образцах определяли в соответствии с оптической плотностью реакционной смеси на спектрофотометре "Multiscan-MCC440", длина волны 492 нм. С помощью компьютерных программ по результатам исследований стандартных растворов строили калибровочную кривую регрессивного анализа и по формуле, описывающей эту кривую, рассчитывали содержание Ig в исследуемых образцах в нг/мл.

3. Фагоцитирующая активность клеток переферической крови.

Принцип методики заключается в том, что на проточном лазерном цитометре регистрируется количество флуоресцирующих полиморфоядерных лейкоцитов, четко выделенных в отдельное окно по прямому и боковому рассеянию лазерного луча, поглотивших ФИТЦ-меченные дрожжи.

С этой целью готовят лейкоцитарную суспензию с концентрацией полиморфоядерных лейкоцитов 10-6/мл на среде 199. Лейкоцитарную суспензию получают стандартным способом спонтанной седиментации эритроцитов в присутствии 1% желатина. Одновременно готовят суспензию пекарских дрожжей на PBS. Для стандартизации размеров пекарских дрожжей их подращивают в питательной среде Сабуро в течение ночи. Хорошо отмытую суспензию пекарских дрожжей на PBS в концентрации 20 млн/мл инкубируют с равным объемом ФИТЦ-PBS в конечной концентрации последнего 2 мг/мл в течение 1 ч. при комнатной температуре при постоянном встряхивании. По окончании инкубации дрожжи отмывают в PBS тщательнейшим образом не менее 10 раз. Составляется конечная концентрация 4-10 мл на PBS, которая может храниться при - 20^oC не менее месяца.

В опыте 0,1 мл клеточной суспензии смешивается с 0,1 мл аутологичной плазмы, 0,1 мл суспензии пекарских дрожжей (концентрации указаны выше) и 0,2 мл среды 199. При испытании иммуномодулирующего эффекта вместо среды 199 вводили герматранол в соответствующей дозе в объеме 0,1 мл и добавляли 1 мл среды 199.

Смесь инкубируется в течение 60 мин при 37^oC при постоянном встряхивании. По окончании инкубации добавляется 0,5 мл 2% параформальдегида до снятия результата на цитометре. В процессе цитометрии, при составлении программы, выделяется нейтрофильное окно и окно дрожжей. Окна должны быть четко отделены друг от друга. Контрольные пробы не должны давать количество событий в нейтрофильном окне более 100. Введение опытных проб показывает количество событий в нейтрофильном окне и процент флуоресцирующих клеток, поглотивших ФИТЦ-меченые дрожжи.

С учетом количества событий в нейтрофильном окне в контрольных пробах, а также количества событий и процента флуоресцирующих клеток в этом же окне в опыте рассчитывают фагоцитарный индекс (ФИ).

4. Люминолзависимый хемолюминесцентный ответ фагоцитирующих клеток.

Забор крови осуществляли в утренние часы натощак. Использовали гепаринизированную (20 ед/мл) кровь, взятую из локтевой вены. Лейкоцитарную суспензию получали стандартным способом спонтанной седиментации эритроцитов в присутствии 1% желатина. Нейтрофилы выделяли с помощью двойного градиента плотности Ficoll-Pague ("Pharmacia"). Жизнеспособность клеток после выделения составляла 98-99% (по методу окраски 0,1% раствором трипанового синего "Serva"). Выделенные нейтрофилы трижды отмывались раствором Хенкса с феноловым-красным (Институт Полиомиелита и Вирусных Энцефалитов АМН РФ) и затем ресуспендировались в стерильной охлажденной среде 199 (Институт Полиомиелита и Вирусных Энцефалитов АМН РФ). Полученная суспензия нейтрофилов доводилась до концентрации 1,8 млн/мл.

Исследование хемилюминесцентной активности нейтрофилов проводилось на приборе Luminometer 1251 (LKB) при 37^oC в две стадии: спонтанная люминесценция и люминесценция, индуцированная зимозаном.

Для регистрации спонтанной люминесценции в каждую измерительную кювету добавлялось: 100 мкл раствора люминола, 300 мкл суспензии нейтрофилов и 100 мкл раствора герматранола с концентрациями 0,05, 0,5, 5 и 50 мкг/мл в среде 199. В качестве отрицательного контроля вместо герматранола добавляли 100 мкл среды 199. Фоновое значение спонтанной люминесценции оценивалось по люминесценции пробы, не содержащей нейтрофилов. Регистрация спонтанной люминесценции нейтрофилов осуществлялось в течение 60 мин.

Для оценки индуцированной хемилюминесценции в кюветы добавлялось либо 100 мкл взвеси частиц этмозана ("Биолар"), опсонизированного нормальной пуловой сывороткой крови человека в концентрации 20 мг/мл в растворе Хенкса, либо для оценки фонового значения равное по объему количества раствора Хенкса. Регистрация индуцированной люминесценции проводилась в течение 60 мин.

Индекс стимуляции (ИС) хемилюминесценции оценивался по формуле

где ИХ - величина индуцирвованной хемилюминесценции;
СХ - величина спонтанной хемилюминесценции;
ФИ - фоновые значения индуцированной люминесценции;
ФС - фоновая величина спонтанной люминесценции.

1. Пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА. Испытано влияние герматранола в дозах 50, 5, 0,5 и 0,05 мкг/мл на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови доноров на ФГА (табл. 1, 2, 3, 4). Оказалось, что в дозе 50 мкг/мл герматранол существенно не влияет на пролиферативный ответ лимфоцитов (табл. 1). Однако в меньших дозах герматранол всегда оказывает слабый стимулирующий эффект (табл. 2, 3, 4) на этот показатель функциональной активности Т-лимфоцитов.

2. Синтез иммуноглобулинов in vitro. Препарат герматранол оказывал разнонаправленный эффект на синтез различных классов Ig in vitro (табл. 5, 6, 7). В наибольших дозах (50 и 5 мкг/мл) герматранол вызывал подавление синтеза основных классов иммуноглобулинов: G, A, M. В дозе 0,5 мкг/мл влияния на синтез иммуноглобулинов практически не оказывал. При применении дозы 0,05 мкг/мл герматранол оказывал выраженный стимулирующий эффект на синтез основных классов иммуноглобулинов. Особенно сильный эффект наблюдался при применении герматранола в отношении синтеза IgA и IgM, где герматранол оказывает стабильное стимулирующее действие. Стимулирующий эффект герматранола наблюдался и в отношении IgG, но здесь он выражен в меньшей степени. Интересен эффект герматранола на синтез IgG у донора 2 (табл. 6): у этого донора синтез IgG in vitro снижен. Герматранол полностью восстанавливает способность синтезировать этот иммуноглобулин. Интересным является эффект герматранола на синтез минорных иммуноглобулинов: IgE и IgD. Герматранол вызывал выраженное повышение синтеза IgE (табл. 8), практически у всех доноров. Синтез IgD под влиянием герматранола был повышен только у одного донора (табл. 9).

3. Фагоцитирующая активность клеток периферической крови. Применение двух доз герматранола: высокой и средней, показало отсутствие эффекта этого препарата на поглотительную способность фагоцитарных клеток (табл. 10).

4. Люминолзависимый хемилюминесцентный ответ фагоцитирующих клеток. Результаты по изучению влияния герматранола на образование активных форм кислорода, регистрируемых по люминолзависимой хемилюминесценции, представлены в табл. 11. Оказалось, что в высоких дозах - 50 мкг/мл, герматранол несколько подавляет спонтанную хемилюминесценцию, т.е. функциональную активность фагоцитирующих клеток. В более низких дозах - 5, 0,5 и 0,05 мкг/мл герматранол не оказывает влияния на этот показатель. На индуцированную хемилюминесценцию герматранол влияния не оказывает ни в одной из испытанных доз.

Таким образом проведенные исследования позволили выявить у герматранола выраженную способность стимулировать синтез иммуноглобулинов in vitro. Это проявляется в усилении продукции IgG, IgA, IgM. Наблюдается также усиление синтеза IgE под влиянием этого препарата. Усиливающий эффект выявляется при применении только низких доз препарата, что говорит в пользу его положительного физиологического действия.

Полученные результаты дают основания сказать, что препарат является стимулятором B-системы иммунитета, при этом не обладает способностью стимулировать T-систему иммунитета и фагоцитоз.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в качестве средства, стимулирующего В-систему иммунитета. Сущность изобретения: применение в качестве стимулятора В-системы иммунитета соединения 1-гидроксигермантрана (моногидрата). Применение предлагаемого средства стимулирует синтез иммуноглобулинов IgG, IgGA, IgGM, а также усиливает синтез Ie E. 11 табл.

Применение 1-гидроксигерматрана моногидрата в качестве средства, стимулирующего в эксперименте синтез иммуноглобулинов.