Способ определения естественной киллерной активности клеток Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клинической и экспериментальной медицины для характеристики функционального состояния иммунной системы.

Цель изобретения - упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

К 10 мл гепаринизиров;.нной крови из вены (25 ед/мл) добавляют 1 мл 10%-ной желатины и инкубируют 35 мин при 37°С до оседания эритроцитов. Взвесь лейкоцитов в плазме наслаивают н j градиент фиколла-ве- рографина плотностью 1,077 и центрифугируют 45 мин при 450 д. Отсасывают интерфазу (мононуклеары), дважды отмывают клетки средой 199 и суспендируют в полной питательной среде (ППС), состоящей из среды RPM1/1640 с добавлением 1-глютамина (300 мг/мл), 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и 0,08 мг/мл гентамицина. Клетки разводят до концентрации 2 106/мл. В пять лунок пластиковых

плоскодонных планшетов помещают по 0,1 мл взвеси клеток. В две лунки добавляют по 0,1 мл фитогепагглютинина(ФГА)в разведении 1:100 на ППС, в остальные лунки - 0,1 мл ППС. Планшеты инкубируют 48 ч при 37°С в атмосфере 5%-ного углекислого газа. Затем планшеты центрифугируют, надоса- дочную жидкость отсасывают и отмывают клетки один раз средой 199. Во все лунки добавляют по 0,1 мл ППС, клетки ресуспен- дируют.

Культивированные клетки смешивают следующим образом.

1(опыт). К нестимулированным лимфоцитам добавляют стимулированные ФГА- лимфоциты (бласты);

2(контроль 1). К стимулированным лимфоцитам добавляют 0,1 мл ППС;

3(контроль 2). К нестимулированным лимфоцитам добавляют нестимулированные лимфоциты.

Планшеты инкубируют еще 18 ч, после чего во все лунки добавляют 3Н-тимидин (1 мкм Си), инкубируют 4 ч, клетки переносят на фильтры и после общепринятой обрабо(/

С

ос С

С7

3

N:

тки определяют уровнеь радиоактивности на бета-счетчике.

Расчет результатов проводят по формуле

К1-0 . 100

Ki -К2

где О - число импульсов в опытной пробе;

Ki - число импульсов в перврм контроле;

Ка - число импульсов во втором контро- ле.

П р и м е р 1. Больной Г., 36 дет. Диагноз: инфильтративный туберкулез лёгких, БК+.

20,03.89. Из вены больного взято 10 мл крови, добавлено 250 ед, гепарина и 1 мл 10%-ной желатины. Кровь инкубируют 35 мин, затем взвесь лейкоцитов в плазме наслаивают на градиент фиколл-верографина и центрифугируют 45 мин при 1500 об/мин, Отсасывают интерфазу, дважды отмывают клетки средой 199 и суспендируют клетки в полной питательной среде (ППС). Клетки разводят до концентрации 2 106/мл. В пять лунок пластикового планшета помещают по 0,1 мл взвеси клеток. В две лунки добавляют по 0,1 мл OTA(Difco P) в разведении 1:100, в остальные лунки - по 0,1 мл ППС. Планшет инкубируют 48 ч при 37°С в атмосфере 5%- ного углкислого газа. Планшет отцентрифу- гировали. Затем клетки отмывают один раз средой 199, во все лунки добавляют по 0,1 мл ППС и клетки ресуспендируют. Далее проводят смешивание клеток: к нестимулированным лимфоцитам добавляют стимулированные лимфоциты (бласты) - опыт, к стимулированным лимфоцитам добавляют 0,1 мл ППС (контроль 1), к нестимулированным лимфоцитам добавляют нестимулированные лимфоциты (к онтроль 2). Планшет инкубируют еще 18ч при тех же условиях. За 4 ч до окончания инкубации во все лунки вносят 1 мкКи 3Н-тимидина. Ресуспендированную клеточную взвесь переносят на бумажные фильтры размером 2x2 см. Фильтры высушивают в течение 1 сут при комнатной температуре, помещают в стеклянный сосуд и отмывают дважды, 0,9%- ным раствором хлористого натрия по 5 мин и 5%-ной трихлоруксусной кислотой в течение 1 сут при 4°С. Затем промывают еще двукратно 5%-ной трихлоруксусной кислотой по 5 мин и фиксируют 96-ным спиртом 2 мин, высушивают, помещают в 5 мл сцин- тиллятора (РРО-РОРОР-толуол) и просчитывают на жидкостном сцинтилляционном спектрофотометре (1 KB, Швеция). Результаты регистрируют по числу импульсов в 1 мин.

Получены следующие показатели: опыт - 6728; контроль 1 - 15713; контроль 2 - 5127.

Расчет: 15713-5127 1°° 8488 % Предлагаемый способ прост, так как отпадает необходимость в постоянных пересевах клеток, как это делается в известном способе поддерживания жизнеспособности опухолевых линий клеток.

В связи с этим уменьшается время выполнения анализа и исключается использование полных питательных сред, что дает значительный экономический эффект

Формула изобретения

Способ определения естественной кил- лерной активности клеток, включающий инкуба цию лимфоцитов с мечеными клетками-мишенями с последующим определением уровня радиоактивности, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве клеток-мишеней используют лимфоциты, обработанные фитоге- магглютинином, а естественную киллерную активность определяют по уровню включения радиоактивного меченого 3Н-тимидина.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения естественной киллерной активности клеток Цель изобретения - упрощение способа У обследованного берут кровь, выделяют лимфоциты, инкубируют их с лимфоцитами, обработанными фитогемагглютинином, и по уровню включения ЗН-тимидина выявляют естественную киллярную активность. По сравнению с известным способом упрощается методика постановки исследования, так как отпадает необходимость в введении серийных пассажей перевиваемых культур.