ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высоковязкий экзополисахарид (ЭПС), который может быть использован, в частности, в нефтедобывающей промышленности.

Известен штамм Acinetobacter sp.ВКПМ-3243, являющийся продуцентом полисахарида [1], но с использованием дефицитного сырья, такого как дикарбоновые кислоты.

Известна возможность получения экзополисахарида путем культивирования штамма Bacillus polymyxa ВКПМ-3015 [2]. Экзополисахарид, полученный с его помощью, имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известен штамм Pseudomonas putida ИБ 17, продуцирующий экзополисахариды [3]. Недостатком известного штамма, принятого за прототип, является низкий выход экзополисахарида.

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение ассортимента экзополисахаридов.

Поставленная задача решается применением в качестве продуцента экзополисахарида штамма бактерий Paenibacillus ehimensis IB 739.

Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером №В-2680Д и первоначально был описан [4] как штамм бактерий для получения препарата против грибковых заболеваний злаковых культур, штамм выделен из почвенного образца серой лесной среднегумусной почвы, отобранной в Бакалинском районе.

Культурно-морфологические признаки штамма. Клетки палочковидные, 0,5-0,8×2,0-4,0 мкм, подвижные, грамположительные. Споры эллиптические, расположены субтерминально, также обнаружено, что споры могут быть расположены терминально, спорангий раздувают.

На мясопептонном агаре (МПА) через сутки инкубации при 36-37°С образуют слизистые, выпуклые, непрозрачные колонии кремового цвета диаметром 2-3 мм. Через 5 суток колонии принимают складчатую форму с высоким бортиком по краю и достигают в диаметре 4-6 мм. Часть колоний (примерно 10%) остается гладкой, не увеличиваясь в размерах. На картофельном агаре (КА) через сутки инкубации при 36-37°С образуют мелкие слизистые, выпуклые и непрозрачные колонии диаметром 1-2 мм. На третьи сутки колонии трансформируются в складчатые, незначительно увеличиваясь в диаметре (до 3-4 мм).

На агаризованной среде, содержащей 1,0% крахмала; 0,1 - К₂НРО₄; 0,2% (NH₄)₂HPO₄; 0,3% полипептона; 0,3% дрожжевого автолизата; 0,3% кукурузного экстракта и 1,2% агар-агара в водопроводной воде, через сутки инкубации при 37°С образуются слизистые, поднимающиеся над агаром колонии диаметром 2-3 мм. На третьи сутки часть колоний покрывается глубокими морщинами, а часть остается гладкой. Через 7-10 суток морщинистость исчезает, колонии становятся уплощенными и приобретают темно-коричневую окраску. На жидкой картофельно-глюкозной среде образуется слизистый осадок. Аэроб. Хорошо растет в интервале температур 30-45°С. Усваивают глюкозу, сахарозу, арабинозу, маннит, глицерин, этанол. При сбраживании сахаров газ не образует. Гидролизует крахмал. В качестве источника азота усваивает как органические формы (пептоны, автолизаты, экстракты), так и минеральные (соли аммония, нитраты). На безазотистой среде Эшби рост слабый. При применении в качестве единственного источника азота KNO₃ или NaNO₃ в жидкой культуре выделяет большое количество полисахаридов, вплоть до гелеобразного состояния. На средах с крахмалом образует кристаллы циклодекстринов. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Индол не образует. Растет при рН 5,0-8,5. Методом анализа нуклеотидной последовательности 16S РНК штамм идентифицирован как Paenibacillus ehimensis [5]

При ферментации указанного штамма бактерий на питательной среде Федорова [6], не содержащей минеральных источников азота, с добавлением мелассы наблюдается образование экзополисахаридов.

Состав питательной среды Федорова, г/л: K₂HPO₄ - 0,3; СаНРО₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; меласса - 30; смесь микроэлементов - 1 мл; вода водопроводная до 1 л.

Состав экзополисахарида определен методами ИК-, ¹Н, ¹³С - ЯМР-спектроскопии. Выделенный экзополисахарид представляет собой альгинат, содержащий в своем составе фрагменты β-D-маннуроновой (М) и α-L-гулуроновой (G) кислот, находящиеся в пиранозной форме и связанные в линейные цепи 1→4 гликозидными связями соотношение M/G - 0,64. Молекулярная масса, определенная при помощи эксклюзионной ВЭЖХ, составляет 320 кДа. Полученный полисахарид нерастворим в холодной воде, хорошо растворим в горячей воде (при температуре от 60°С и выше).

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Paenibacillus ehimensis IB 739 продуцирует значительное количество экзополисахарида (25 г/л) при выращивании в течение 72 ч в ферментере объемом 10 литров при коэффициенте заполнения 0,7 на среде Федорова с добавлением мелассы в качестве источника углерода. При температуре процесса, составляющей 35°С, числе оборотов перемешивающего устройства 350 мин^-1, расходе воздуха 100 л/час образовывалась высоковязкая культуральная жидкость с кинематической вязкостью 30000 сСт. Далее экзополисахарид извлекают из культуральной жидкости осаждением изопропиловым спиртом в объемном соотношении 1:1. Далее определялют кинематическую вязкость 0,1% и 0,25% водных растворов ЭПС при помощи стеклянного капиллярного вискозиметра Оствальда при 20°С.

Для 0,1% и 0,25% водных растворов ЭПС штамма Paenibacillus ehimensis IB 739 кинематическая вязкость составила 1,90 сСт и 5,45 сСт соответственно. Для 0,1% и 0,25% растворов ЭПС штамма по прототипу кинематическая вязкость составила 1,15 сСт и 1,40 сСт соответственно. Таким образом, заявляемый штамм продуцирует экзополисахарид, который превосходит по реологическим характеристикам экзополисахарид по прототипу.

Пример 2. При использовании высоковязких экзополисахаридов в нефтедобывающей промышленности важной технологической характеристикой является их растворимость в высокоминерализованных нефтепромысловых пластовых водах. При этом расслоение геля при смешении с пластовой водой или образование осадка недопустимо с точки зрения повышения эффективности процесса добычи нефти при закачке экзополисахаридов в продуктивные пласты. Изучали растворимость культуральной жидкости предлагаемого штамма бактерий Paenibacillus ehimensis IB 739, полученной по примеру 1, и культуральной жидкости штамма по прототипу в нефтепромысловых пластовых водах. Для этого смешивали 0,1%-ный раствор культуральной жидкости предлагаемого штамма и штамма по прототипу в водопроводной воде с нефтепромысловой пластовой водой, имеющей степень минерализации 140 г/дм³ в различных соотношениях по объему - от 1:1 до 1:15. Результаты экспериментов, приведенные в табл.1, свидетельствуют о хорошей растворимости культуральной жидкости, полученной при ферментации предлагаемого штамма бактерий, в высокоминерализованных пластовых водах, не уступающей растворимости штамма по прототипу. Во всех вариантах эксперимента при смешении культуральной жидкости штамма Paenibacillus ehimensis IB 739, содержащей экзополисахарид, с пластовой водой мы получили однородный гель, который не проявлял тенденции к расслоению.

Таким образом, предлагаемый штамм Paenibacillus ehimensis IB 739 обладает высокой продуктивностью при секреции высоковязкого экзополисахарида в среду. Гель, полученный при этом, обладает хорошей растворимостью в минерализованных пластовых водах.

Таблица 1 Растворимость культуральной жидкости штамма бактерий Paenibacillus ehimensis IB 739 в нефтепромысловой воде (минерализация - 140 г/дм³) Наименование штамма бактерий Объемное соотношение 0,1%-ного раствора культуральной жидкости с пластовой водой 1:1 1:3 1:10 1:15 Paenibacillus ehimensis IB 739 Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Штамм по прототипу Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается Однородный гель, не расслаивается

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1579049, кл. С12Р 19/04, 1990.

2. Авторское свидетельство СССР №1698293, кл. С12Р 19/04, 1991.

3. Патент РФ №2343193, кл. С12N 1/20, 2009.

4. Авторское свидетельство СССР №1743019, кл. С12N 1/20,1994.

5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FN582329.1?report=girevhist

6. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. - Киев: АН УССР, 1960. - 328 с.

Изобретение относится к применению штамма Paenibacillus ehimensis IB 739 в качестве продуцента экзополисахарида. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером B-2680D. Штамм способен продуцировать 25 г/л экзополисахарида. Изобретение позволяет получить экзополисахарид, обладающий высокими реологическими характеристиками и хорошей растворимостью в высокоминерализованных нефтепромысловых пластовых водах. Кинематическая вязкость 0,1% и 0,25% водных растворов экзополисахаридов составляет 1,90 сСт и 5,45 сСт соответственно. 1 табл., 2 пр.

Применение штамма бактерий Paenibacillus ehimensis IB 739, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером B-2680D, в качестве продуцента экзополисахарида.