ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИСЫВОРОТКИ К ТРАНСТИРЕТИНУ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицинской промышленности при создании иммунных тест-систем для определения транстиретина (TTP) человека в биологических жидкостях.

Исследование содержания TTP в сыворотке крови больных применятся для оценки степени недостаточности и контроля за эффективностью лечебного питания, при мониторинге развития недоношенных новорожденных. Изменение уровня TTP в динамике патологического процесса является чувствительным критерием для оценки тяжести состояния больных при термической, черепно-мозговой травме, некоторых терапевтических заболеваниях.

Основным этапом создания диагностической тест-системы является получение моноспецифической антисыворотки. При иммунизации животных очищенным препаратом транстиретина получают антисыворотки, содержащие, как правило, в качестве примеси антитела к белкам плазмы крови человека. В связи с этим имеется необходимость в удалении неспецифических антител из таких антисывороток к TTP человека. Адсорбцию антисывороток рекомендуется проводить на адекватных сорбентах, содержащих белки, взаимодействующие с примесными антителами [1,2,3] Однако универсального сорбента не существует.

Задачей данного изобретения является создание универсального иммуносорбента, повышающего специфическую активность антисыворотки к TTP человека.

Для создания универсального сорбента необходимо иметь биологическую среду человека, содержащую все белки плазмы крови, за исключением TTP. В процессе адсорбции эти белки будут взаимодействовать с неспецифическими антителами и, следовательно, повышать активность антисыворотки к TTP человека.

Уникальная биологическая среда человека нами обнаружена. Установлено, что в "промывной" фибринолитически активной плазме (ПФАП) крови человека отсутствует TTP и содержится широкий спектр белков плазмы крови (табл. 1). Такая специфическая трансфузионная среда широко используется в клинической практике в качестве тромболитического средства [4]
Процесс "истощения" антисывороток наиболее технологичен при наличии твердого иммуносорбента, поэтому для его создания был использован сшивающий агент и наполнитель овальбумин.

Поставленная задача решается смешиванием ПФАП и овальбумина до концентрации общего белка 75-110 мг/мл, применением сшивающего агента - глутарового альдегида в конечной концентрации 0,7-0,8 об. отмывкой полученного иммуносрбента в буферных растворах при различных pH.

Иммуносорбент готовят следующим образом: к ПФАП с определенной концентрацией белка добавляют овальбумин до концентрации 75-110 мг/мл по общему белку. К этой смеси добавляют 2,5% раствора глутарового альдегида до конечной концентрации 0,7-0,8 об. по каплям, при постоянном перемешивании. Через три часа при комнатной температуре образуется гель, который измельчают при помощи гомогенизатора и отмывают различными буферными растворами.

"Истощение" антисыворотки к TTP человека осуществляют: в центрифужной пробирке смешивают антисыворотку к TTP, содержащую неспецифические антитела и полученный иммуносрбент в соотношении 1:1. Смесь перемешивают на шуттелле в течение 30-40 мин при комнатной температуре. Адсорбированную антисыворотку фильтруют и подвергают иммунохимическому исследованию.

Пример.

Приготовление иммуносорбента:
К 50 мл ПФАП (pH 7,0) с концентрацией общего белка 10,2 мг/мл (общий белок пула составил 510 мг) добавляют 3500 мг порошка овальбумина и тщательно перемешивают. После полного растворения протеина, по каплям, при постоянном перемешивании к смеси добавляют 15 мл 2,5% раствора глутарового альдегида. В течение 3 ч при комнатной температуре образуется гель, который измельчают в гомогенизаторе и попеременно отмывают в 0,2М фосфатном буфере (pH 7,3) и 0,1М ГЛИЦИН•HC1 (pH 2,8). Измельченный гель (иммуносорбент) хранят во флаконе с 0,02 раствором азида натрия при +4-6^oC до момента использования.

Адсорбция антисывороток к TTP человека:
В центрифужной пробирке смешивают 5 мл антисыворотки к TTP человека (серия 8-664/2 с исходным специфическим титром 1:10) и 5 мл иммуносорбента. Смесь перемешивают на шуттелле в течение 35 мин при комнатной температуре. Адсорбированную антисыворотку отделяют от твердого сорбента путем фильтрования и подвергают иммунохимическому анализу. Титр адсорбированной антисыворотки составил 1:4, в ней выявлены антитела только к TTP человека.

Проверка активности полученного твердого иммуносрбента проводилась при истощении 5 серий антисывороток к TTP человека. Специфичность адсорбированных антисывороток проверялась методом преципитации в геле по Оухтерлони и посредством иммуноэлектрофореза (фиг. 1,2). В качестве референс-антисыворотки использовалась сыворотка против TTP "Sevac" (Чехословакия), а антигена TTP цельная сыворотка крови человека (смесь образцов от 50 доноров). Титр полученных моноспецифических антисывороток к TTP составил в среднем 1:6 (табл. 2).

Иммунодиффузионный анализ антисывороток после адсорбции показал, что во всех сериях они содержали только антитела к TTP человека и стандартному антигену TTP человека ("Sigma", США). Иммунопреципитацией доказана полная идентичность антигенных структур TTP человека. Во всех адсорбированных антисыворотках полностью отсутствовали неспецифические антитела.

Эффективность адсорбции неспецифических антител дополнительно исследована посредством иммуноэлектрофореза и перекрестного иммуноэлектрофореза (фиг. 2). Титр специфических антител в адсорбированных антисыворотках к TTP варьировал от 1:4 до 1:8.

Таким образом, полученный иммуносорбент позволяет одномоментно удалить все неспецифические антитела из антисывороток к TTP человека, его использование сокращает время адсорбции и позволяет существенно удешевить производство диагностикума к TTP человека. Отметим, что полученный иммуносорбент можно многократно использовать.

Литература
1. Иммунохимический анализ. Под ред. Зильбера Л.А. Москва, "Медицина", 1968, с. 294.

2. Иммунологические методы. Под ред. Фримеля Г. Москва, "Медицина", 1987, с. 472.

3. Антитела. Методы. Под ред. Кэтти Д. Москва, "Мир", 1991, 2 ч, 382.

4. В. Б.Хватов. "Препараты фибринолитического и антипротейного действия из плазмы крови внезапно умерших людей". Автореферат докторской диссертации. М. 1984, 48 с.

Использование: в медицине, при создании иммунных тест-систем для определения транстиретина (ТТР) человека в биологических жидкостях. Сущность изобретения: иммуносорбент для получения моноспецифической антисыворотки к ТТР человека включает фибринометически активную плазму крови человека с содержанием общего белка 15±5,8 мг/мл, свободную от транстиретина, овальбумин в концентрации 65-90 мг/мл и в качестве сшивающего агента глутаровый альдегид в конечной концентрации 0,7-0,8 об.%. Иммуносорбент позволяет одномоментно удалить все неспецифические антитела из антисывороток к ТТР человека, сокращает время адсорбции и позволяет существенно удешевить производство диагностикума к ТТР человека. 2 ил., 2 табл.

Иммуносорбент для получения моноспецифической антисыворотки к транстиретину человека, включающий промывную фибринолотически активную плазму крови человека с содержанием общего белка 15 ± 5,8 мг/мл, свободную от транстиретина, овальбумин в концентрации 65 90 мг/мл и в качестве сшивающего агента глутаровый альдегид в конечной концентрации 0,7 0,8 об.