Рекомбинантная плазмидная ДНК @ 22, кодирующая синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека Советский патент 1992 года по МПК C12N15/21 A61K37/66 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой сконструированную in vitro плазмиду, обеспечивающую биосинтез лейкоцитарного интерферона человека, и штамм Pseudomonas sp. - продуцент лейкоцитарного интерферона. содержащий эту плазмиду.

Цель изобретения - повышение выхода интерферона а -И.

На чертеже показана схема конструирования плазмиды pVN 22.

П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pVN22.

0.2 мкг ДНКплазмиды pAYC37(Plasmid. 14, 118-125, 1985) и 1 мкг ДНК известной плазмиды pVN 609 расщепляют рестрикта- зами EcoRI и Hindlll в следующих условиях:

6 мМ трис-CI, рН 7.6. 6 мМ MgCl2, 6 мМ 2-меркаптоэтанола и 50 мМ NaCI; EcoRI - 2 ед. активности, Hindl.ll - 2 ед. активности; обьем реакционной смеси 30 мкл. Реакцию проводят 40 мин при 37°С и останавливают прогреванием в течение 15 мин при 65°С. Затем проводят смешивание полученных фрагментов с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Лигирование проводят при 12-14°С в течение 120 мин, после чего такую смесь трансформацией вводят в E.coli C600.

Трансформацию проводят следующим образом. Ночную культуру E.coli C600 в 500 раз разводят жидкой средой LB (7) и растят на качалке с аэрацией при 37°С до достижения культурой клеток оптической плотности 0,4-0,6 ед. при 550 нм. Затем суспензию клеток охлаждают в ледяной бане, собирают центрифугированием,суспенXI

О

GJ о ю о

дируют в ледяном растворе 0,1 М CaCl2, после чего суспензию на 30 мин помещают в ледяную баню. Затем клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в 1/20 первоначально объема клеточной сус- пензии. К 100 мкл приготовленных таким образом клеток добавляют 30 мкл раствора ДНК после лигирования и после тщательного перемешивания полученную смесь составляют на 30 мин в ледяной бане, затем проводят прогревание смеси, помещая п ро- бу в водяной термостат с температурой 42°С на 4-5 мин, после чего пробу снова помещают на 20 мин в ледяную баню.

Затем суспензию в десять раз разводят средой LB и на 2,0-2.5 ч помещают в термостат 37°С. Такая длительная инкубация необходима для проявления устойчивости к стрептомицину. После подращивания 10- 50 мкл клеточной культуры высевают на ага- ризованную LB-среду, содержащую в качестве селективных маркеров стрептомицин (100 мкг/мл) и эмпициллин (100 мкг/мл).

кторная плазмида pAYC37 не способ- н 1 восстановлении дать трансформан- TL 1 такой среде, так как не обладает устойчивостью к стрептомицину. Промотор, с которого происходит экспрессия стрепто- мицинустойчивости, у pAYC37 отсутствует. При клонировании промотор-содержащего фрагмента с интерфероном а -Ц из pVN 609 в pAYC37 происходит восстановление устойчивости к стрептомицину, что позволяет легко отбирать клоны, содержащие искомые плазмиды. Из таких клонов щелоч- ным методом выделяют плазмидную ДНК и анализируют структуру плазмид с помощью рестриктаз HindlJJ и EcoR в указанных условиях. Анализ получаемых фрагментов проводят с помощью электрофореза в 1 %-ном агарозном геле в стандартном трис-борат- ном буфере с последующим прокрашивани- ем геля бромистым этидием, что позволяет увидеть фрагменты ДНК в длинноволновом ультрафиолете. Идентифицирована плазмида pVN 22.

П р и м е р 2. Получение штамма Pseudomonas sp. 31 (pVN 22), продуцирующего интерферон а-П.

Для введения плазмиды pVN 22 в Pseudomonas sp. 31 применяют две последовательные конъюгации. Сначала в штамм E.coll C600 (pVN 22) конъюгацией вводят плазмиду R751, которая обеспечивает устойчивость к триметаприму.

Высев конъюгатов производят на минимальную агаризованную солевую среду Адамса, содержащую следующие компоненты: глюкоза 4 мг/мл: тиэмингидрохлорид 5 мкг/мл; треонин 50 мкг/мл; лейцин 50 мкг/мл; ампициллин 75 мкг/мл; стрептомицин 75 мкг/мл; триметаприм 75 мкг/мл. В этих условиях вырастают только конью- гаты E.coli C600 (R 751, pVN 22). Затем проводят конъюгацию между E.coli C600(R 751. pVN 22) и Pseudomonas sp. 31 с дефектным геном thr А. Конъюгэты вырастают на минимальной агаризованной солевой среде следующего состава: глюкоза 4 мг/мл; тиамингидрохлорид 5 мкг/мл; треонин 50 мкг/мл; ампициллин 75 мкг/мл, стрептомицин 200 мкг/мл, триметаприм 75 мкг/мл. Температура роста конъюгантов 30°С. Штамм-донор СбОО (R 751, pVN 22), помимо треонина, нуждается еще и в лейцине, поэтому на такой среде не вырастает. В результате получен штамм Pseudomonas sp. 31 (pVN 22), содержащий плазмиду, которая обеспечивает синтез интерферона а-11.

Штамм Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидные длиной 3-5 мк, гра- мотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. На мясопептонном агаре через 24 ч роста при 25-30° образуют крупные колонии с неровным краем (диаметр 3-4 мм), поверхность шероховатая, цвет светло-зеленый. При росте на бульоне Хоттингера или М 9 с добавками казаминокислот образуется равномерная муть. Через 24 ч роста на бульоне Хоттингера с аэрацией культура приобретает светло-зеленый цвет и слегка опалесци- рует.

Физиолого-биохимические признаки. Клетки Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) растут при 10-35° с оптимумом 30°С при рН 6,7- 7,5. Источники углерода: глюкоза, арабино- за. Источники азота: соли аммония, мочевина, могут быть также аминокислоты, пептон, триптон и т.п.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки Pseudomonas sp. 31(pVN 22) обладают устойчивостью к 400-500 мкг/мл стрептомицина и 150-200 мкг/мл ампициллина.

Стабильность плазмиды в штамме. При поддержании клеток Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) в течение 6 мес на агаризованной среде, содержащей ампициллин и стрептомицин в соответствующих концентрациях, не наблюдаются потери или перестройки плазмиды.

П р и м е р 3. Культивирование Pseudomonas sp. 31 (pVN 22).

Штамм Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) вы- ращивгют при 28°С с течение 14 ч на скошенной агаризованной стандартной среде

Хоттингера, содержащей антибиотики: ампициллин 75 мкг/мл, стрептомицин 150 мкг/мл. Триметаприм в среду не добавляется, так как наличие плазмиды R751 на продукцию интерферона не влияет. Вы- росшую на косяках биомассу используют для приготовления посевного материала. Для этого клетки переносят в колбы Эрлен- мейера объемом 750 мл со 100 мл указанной среды, но без агара и выращивают на качал- ке при перемешивании (240 об/мин) в тече- ние нескольких часов при 280C 0-Ds50 посевной культуры должна быть равна приблизительно 1,0-2,5. Ферментацию проводят в ферментере, оснащенном системами для регулирования температуры, рН, скорости перемешивания и аэрации, датчиком для измерения парциального давления растворенного кислорода.

Посевную культуру вносят в количестве 5% в ферментер с указанной средой. Растят клетки до оптической плотности в стандартных условиях 2-4 при рН 6,7-6,9 и температуре 28±0,5°С. Проводят интенсивную аэрацию и перемешивание. Режим, аэра- ции и перемешивания подбирают так, что рост культуры не лимитируется концентрацией растворенного кислорода, для чего значение парциального давления кислорода поддерживают на уровне 5-10% от насы- щения. Для стабилизации рН используют аммиачную воду. Рост биомассы контролируют по изменению оптической плотности культуральной среды. После окончания ферментации активность интерферона состав- ляет2,5 х 109 МЕ/л.

Таким образом, создана плазмида, обеспечивающая синтез нового вида человеческого лейкоцитарного интерферона GT-I1 и способная реплицироеаться во мно-

гих грамотрицательных бактериях. С помощью полученной плазмиды создан штамм - продуцент интерферона и -11 с активностью до 2,5 х 109 МЕ/л культуральчой жидкости.

Использование интерферона а-11 в качестве добавки к смеси других, уже известных лейкоцитарных интерферонов, также получаемых микробиологическим синтезом, позволяет приблизить лечебный эффект такого комбинированного препарата интерферонов к действию природных лейкоцитарных интерферонов плазмы крови. В дальнейшем возможно и самостоятельное применение интерферона а-11.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмиднэя ДНК pVN 22, кодирующая синтез интерферона человека, имеет размер 10,85 т.п.о. и состоит из следующих элементов:

EcoRJ-HindfII-фрагмента плазмиды р AYC 37 размером 9,45 т.п.о.; Hindlll-EcoRt- фрагмента размером 1,4 т.п.о., внутри которого расположены; участок ДНК и рВР322 диаметром 0,03 т.п.о.: регуляторная область гена D фага уэх 174 размером 0,22 т.п.о.; ген интерферона а -11 размером 0.50 т. п.о.,-участок геномн ой ДНК человека размером 0,65 т.п.о.; генетические маркеры: ген Ар14, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; ген StrR, обеспечивающий устойчивость к стрептомицину; уникальные участки узнавания следующих ре- стриктаз; HindlTl - 0; EcoRl - 1,4 т.п.о.. BamHf - 10,82 т п.о.

2. Штамм Pseudomonas sp. ВКПМ В- 3480 - продуцент интерферона а- человека.

EcoRI

EcoRI

Hindi EcoRI

Bom HI

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой сконструированную in vitro плазмиду. обеспечивающую биосинтез лейкоцитарного интерферона человека, и штамм Pseudomonas sp. - продуцент лейкоцитарного интерферона, содержащий эту плазмиду. Целью изобретения является повышение выхода интерферона сг-П человека. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVN 22. кодирующая синтез интерферона с:-И человека, состоит из и НтсПП-фр&г- ментов плазмиды pAYC37. Штамм Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) ВКМВ-3480 - продуцент интерферона а-|1 человека. 2 с.п. ф-лы. 1 ил.