Рекомбинантная плазмидная ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующая синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструирования, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека Советский патент 1992 года по МПК C12N15/23 C12P21/00 C12N1/21 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, молекулярной биологии и генно-инженер- ной биотехнологии и представляет собой сконструированную рекомбинантную плаз- мидную ДНК. обеспечивающую микробиологический синтез фибробластного интерферона человека, способ ее конструирования и штамм E.coli, содержащий эту рекомбинантную плазмиду,- продуцент/ I- интерферона человека.

Целью изобретения является повышение уровня фибробластного интерферона человека в клетках штамма-продуцента.

Новая плазмида /3 1-13, которая имеет длину около 3.9 тыс.н.п.. обеспечивает экспрессию гена IFN/3 под контролем регуляторной области PROR бактериофага Я, состоит из большого (,4 т.н.п.) ВамН1-Вд1 Н-фрагмента векторной плазми- ды pPR124, модифицированной введением в ее состав олигонуклеотидного BgLII-лин- кера, и ЕсоР -5аиЗА-фрагмента плазмиды plN /3-trp-7 длиной 510 н.п.

Способ конструирования рекомбинзнт- ной плазмиды pPR-IFN/ 1-13 заключается в том, что в состав вектора pPR124 с помощью олигонуклеотидного линкера вводят уникальный участок узнавания рестриктазы BgLII, затем образующуюся таким образом плазмиду pPR124B расщепляют рестрикци- онными эндонуклеазами EcoRI и Bglfl и

4 О

Ч

Ю

ю

проводят соединение большего из образующихся фрагментов векторной молекулы с ЕсоШ-ЗаиЗА-фрагментом, содержащим кодирующую часть зрелого/ 1-интерферона из плазмиды plN/ -trp7, в полученной таким образом рекомбинантной плазмиде pPR- IFN/ 1-123 проводят сближение SD-после- довательности гена его и первого кодона/3 I интерферона, для чего плазмидную ДНК гидролизуют рестриктазой BamHI, удаляют часть нуклеотидов с помощью экзонуклеаз- ной активности ДНК-полимеразы | E.coli, расщепляют ДНК рестриктазой EcoRJ, обрабатывают Sf-эндонуклеазой с последующим полным восстановлением двуцепочечных концов с помощью, Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы j E.coli и обеспечивают циклизацию образовавшихся линейных молекул ДНК ДНК-лигазой фага Т4. Полученным препаратом трансформируют клетки E.coli С.600, отбирают трансформанты на среде с ампициллином при культивировании клеток при 28°С с последующей селекцией на пониженную скорость роста при 42°С. Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК.

Штамм E.coli ВНИИгенетика V4 903 (pPR-IFN ft 1-13), регистрационный номер 1825,в коллекции культур микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков - продуцент фиб- робластного $ 1) интерферона человека.

Штамм получают трансформацией E.coli ВНИИгенетика VL903 (ВКПМ В-3546) рекомбинантной плазмидой pPR-IFN уЗ 1-13 с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде с ампициллином при 28°С и определением активности фибробласт- интерферона в экстрактах клеток Фонсформантов после дерепрессии PR- промотора, достигаемой культивированием ojiai ма в течение 1-12 ч при 42°С. В качестве реципиента могут быть также использованы штаммы E.coli C600, E.coli ВНИИгенетика VL 902 и другие производные E.coli K12.

Штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-JFN/3 ИЗ) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы (1,2-1,6) х х(2,0-6,0) мкм, слабоподвижные, способные к образованию нитевидных форм, грамотри- цательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на плотных и жидких простых синтетических, полусинтетических и комплексных средах. При росте на агаризован- ном бульоне Хоттингера или L-бульоне

образуют ослизненные, круглые, слабоматовые колонии. При выращивании в жидких средах типа L-бульона или М9 с казамино- выми кислотами образуют равномерную взвесь.

Физиологе-биохимические признаки. Клетки способны к росту в диапазоне 5- 40°С (оптимум 35°С) при рН 6,7-7,5. В качестве источника углерода используют

аминокислоты и углеводы (например сахарозу). Источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме, а также органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта и

аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам. Штамм устойчив к ампициллину в концентрации до 100 мг/л при выращивании в жидких и на агаризованных питательных средах.

Стабильность плазмиды. При хранении клеток на агаризованной среде (сроком до одного месяца), при серии последовательных пересевов(в течение не менее 6 месяцев) и в процессе глубинного культивирования в жидкой среде с антибиотиком не происходят потери и перестройки плазмиды.

П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pPR-lFN/3 1-13.

Рекомбинантную плазмид у pPR-IFN/)- 13 получают в несколько этапов.

Этап Г - конструирование векторной плазмиды pPR124B.

3 мкг ДНК плазмиды pPR124 расщепляют рестриктазой Xba.l в 70 мкл буфера для рестрикции - I, содержащего 10 мМ трис- HCI, рН 7,9, 6 мМ MgCl2, 6 мМ 2-меркаптоэ- танола, 150 мМ NaCI. ДНК переосаждают двумя объектами этанола. Осадок растворяют в 15 мкл Н20. Достройку одноцепочных 3-концевых участков ДНК проводят обработкой Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы lE.coli в пробе объемом 20 мкл, содержащей 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 10 мМ

MgCl2, 2 мкг препарата ДНК, по 30 мкМ дезоксирубонуклеозидтрифосфатов, 5 ед. феомента, ДНКиз реакционной смеси переосаждают этанолом и растворяют в 100 мкл Н20.

Воссоединение линеаризованной плаз- мидной ДНК с Bgfll-линкерами проводят при 16°С в течение 12 ч с помощью ДНК-ли- газы фага Т4 в пробе, содержащей буфер для лигиоования (60 мМ трис-HCI рН 7,6,

10 мМ MgCla, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,4 мМ АТФ), 2 мкг плазмидной ДНК и 0,5 мкглинкеров. После проведения лигиро- вания ДНКиз реакционной смеси осаждают этанолом, растворяют и подвергают ферментативному гидролизу рестриктазой в пробе объемом 40 мкл, содержащей буфер для рестрикции - 2 (6 мМ трис-HCI рН 7,6, б мМ MgCl2, 6 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCI). ДНК вновь осаждают этано- лом, растворяют, 1 мкг препарата плаз- мидной ДНК в 240 мкл буфера для лигирования обрабатывают ДНК-лигазой Т4. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli C600.

Эффективность трансформации составляет до 5-10 колоний на 1 мкг нативной плазмиды pPR124. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину (100 мкг/мл), из них выделяют плазмидную ДН К и используют ее для рестрикционного анализа. В результате получают плазмиду pPR124B, которая в отличии от исходной векторной молекулы pPR124 содержит уникальный участок расщепления Bgfll вместо имевшейся последовательности узнавания.

Этап 2 - конструирование промежуточной плазмиды pPR-IFN/З И23.

В состав вектора pPR124B интегрируют кодирующую последовательность фиброб- ластного интерферона человека из плазмиды pJN/ -trp-7. Для этого 10 мкг ДНК /3-trp-7 обрабатывают совместно рестрикта- зами E.coRj и ЗаиЗА в пробе объемом 100 мкл, содержащей буфер для рестрикции - 2. Полученный препарат наносят на гель 1 1 %- ной легкоплавкой агарозы и подвергают электрофорезу в трис-ацетатной буферной системе. Полоску геля, содержащую фрагмент ДНК длиной 510 н.п.. вырезают и ДНК элюируют из геля.

Полученный таким образом фрагмент ДНК ( 1 мкг) интегрируют в плазмиду PPR124B. Для чего 1 мкг ДНК pPR124B расщепляют рестриктазами EcoRI и Bgfll в пробе объемом 20 мкл в буфере для рестрикции - 2. Полученный препарат подвергают фенольной депротеинизации, ДНК осаждают этанолом и растворяют в 10 мкл Н20-0,5 мкг ДНК расщепленной плазмиды pPR124B объединяют с 1 мкг выделенного фрагмента плазмиды plN/ -trp-7 и обрабатывают ДНК-лигазой Т4 в пробе объемом 30 мкл, в буфере для лигирования. Полученным препаратом ДНК проводят трас- формацию клеток E.coli C600 с отбором трансформантов на среде с ампициллином с последующей селекцией Cm -клонов на среде с 200 мкг/мл хлорамфеникола при культивировании клеток при 42°С.

Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК и исследуют с помощью рестрикционного анализа. В полученной плазмиде E.coRI - Bgfll-фрагмент.

кодирующий С-концевую часть хлорамфе- николацетилтрансферазы в составе векюра pPR124B, замещен на кодирующую последовательность зрелого / -интерферона

человека, Данная плазммда обозначена pPR-IFN/31-123.

Этап 3 - конструирование плазмиды pPR-IFN I-13.

30 мкг ДНК плазмиды pPR-IFN /3 j-123

расщепляют рестриктазой ВагпН в 150 мкл буфера для рестрикции - 1, ДНК подвергают фенольной депротеинизации и осаждают этанолом. Осадок растворяют в 40 мкл НаО. Для ограниченной деградации ДНК с помощью У -5 экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы 1 E.coli полученный препарат ДНК инкубируют в пробе объемом 150 мкл, содержащей 50 мМ трис-HCI, рН 8,0, М ЭДТА; 5 мМ MgCl2. 100 мкМ ДАТФ,

а затем дГТФ и 20 ед. ДНК-полимеразы. Реакцию останавливают, проводят переосаждение ДНК и осадок вновь растворяют в 40 мкл НаО. 10 мкг полученного препарата обрабатывают рестриктазой E.coRI в 50 мкл

буфера для рестрикции - 2, проводят фе- нольную депротеинизацию, осаждение ДНК этанолом и растворяют осадок в 30 мкл.

Удаление однонитевых концевых участ

ков полученного препарата ДНК проводят при помощи эндонуклеазы 1 в пробе объемом 100 мкл, содержащей 30 мМ СНзСООМа, рН 4,4г4,5 мМ ZnS04, 250 мМ NaCI, 10 мкг ДНК, 200 ед. Sl-эндонуклеазы.

Реакцию проводят при 20°С, после чего смесь подвергают фенольной обработке и переосаждению нуклеиновой кислоты этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл ЬЬО. 4 мкг полученного таким образом препарата

ДНК обрабатывают Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 E.col в указанных условиях для достройки возможно имеющихся одноцепочечных концов молекул до двухцепочечных. Реакцию останавливают

фенольной депротеинизацией, нуклеиновые кислоты осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл Н20.

Лигирование линейных молекул ДНК с двуцепочечными концами проводят при

16°С в пробе объемом 50 мкл, содержащей 60 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ MgCl2. 1C мМ дитиотреитол, 4 мМ АТФ, 8%-ный полиэти- ленгликоль - 6000. 4 мкг ДНК, 100 ед. ДНК- лигазы Т4. После завершения реакции

пробу разбавляют водой в четыре раза и проводят осаждение нуклеиновых кислот этанолом. 2 мкг растворенной в НаО ДНК обрабатывают рестриктазой ВдП в 30 мкл буфера для рестрикции - 2. ДНК осаждают

из реакционной смеси этанолом, растворяют в воде и обрабатывают ДНК-лигазой Т 4 в 200 мкл буфера для лигирования.

Полученный препарат ДНК используют для трансформации клеток E.coli C600 указанным образом с последующей селекцией трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток в течение суток при 28°С. Среди полученных трансформантов отбирают варианты, обладающие пониженной способностью к росту при 42°С. Из указанных клонов выделяют плазмидную ДНК, указанным образом и подвергают ре- стрикционному анализу.

Для установления первичной структуры гибридного участка связывания рибосом перед геном FN ft 1 в полученной плазмиде pPR-iFN/ ИЗ 30 мкг соответствующей ДНК обрабатывают рестриктазой HlndM в 100 мкл буфера для рестрикции - 2, наносят на градиентный (4-12%) полиакриламидный гель. Электрофорез проводят в трис-ацетат- ной буферной системе.

Фрагмент ДНК длиной-190 н.п. элюиру- ют из геля по методу Максама-Гилберта, к нему присоединяют с помощью ДНК-лигазы Т4 BamHJ-линкеры Callaborative Research (США)аналогично указанному способу. ДНК переосаждают этанолом, осадок растворяют в 20 мкл НаО, расщепляют рестриктазой ВатНГ в 30 мкл буфера для рестрикции - 1, депротеинизируют фенолом, осаждают этанолом и растворяют в НаО.

Молекулярное клонирование образующегося при расщеплении BamHj фрагмента ДНК в составе репликативной формы ДНК бактериофага М13 тр 10, селекция реком- бинантных фагов на индикаторной среде, содержащей 5-бром-4-хлор-3-индолил- /3 -D-галактозид (X-gal), выделение одноцепо- чечной фаговой ДНК и определение первичной структуры клонированного фрагмента с помощью метода ограниченного матричного копирования (метод Ф.Сенгера) осуществляется в соответствии с хорошо разработанными стандартными методами. Установленная методом Сенгера нуклеотид- ная последовательность гибридного участка связывания рибосом в составе плазмиды pPR-IFN 1-13 является следующей: 5 -...TAAGGAGGTTGGATG...-3 , где TAAGGAGGT - SD-последовательность гена его фага A, a ATG - метиониновый кодон {$ -интерферона.

П р и м е р 2. Получение штамма E.coli ВНИИгенетика VE. 903 (pPR-IFN fi 1-13) - продуцента фибробластного интерферона человека.

Плазмиду pPR-IFN ft j-13, кодирующую синтез фибробластного интерферона человека, трансформацией вводят в клетки штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 из коллекции ВНИИгенетика (регистрационный номер ВКПМ В-3546 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов). Эффективность трансформации клеток E.coli ВНИИгенетика VL 903 составляет около

10 клонов на 1 мкг нативной ДНК плазмиды pPR-IFN/ J-13. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), после культивирования клеток в течение суток при 28°С. Из отобранных

клонов выделяют плазмидную ДНК и подтверждают ее идентичность препарату ДН К pPR-JFN/3i-13 с помощью рестрикционного анализа. Полученный штамм E.coli ВНИИгенетика VL903 (pPR-iFN/H-13) депонирован

во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов.

П р и м е р 3. Определение продуктивности штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IFN/ J-13) - продуцента фибробластного интерферона человека.

Для определения продуктивности штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR- IFN /J 1-13) плазмидсодержащие клетки выращивают при 28°С на скошенной

агаризованной стандартной среде Хоттин- гера, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 14 ч. Выросшую на косяках биомассу используют для получения посевного материала. Для этого клетки переносят в

колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды Хоттингера, со 100 мкг/мл ампициллина и выращивают при 28°С на качалке при 240 об/мин в течение 6 ч. Оптическая плотность посевной культуры

составляет 1,5-2,5 ед.

Ферментацию проводят в ферментере, оснащенном системами для регулирования рН, температуры, скорости перемешивания и аэрации. Для ферментации используют

среду Хоттингера со 100 мкг/мл ампиципли- на и 10 г/л глюкозы. Посевную культуру вносят в количестве 5-10%. Культивирование осуществляют при рН 6,6-6,8, поддерживая этот уровень подачей аммиачной воды. Первую часть ферментации до 0. Дб50 3,5 проводят при 28°С, а затем осуществляют термоиндукцию, повышая температуру до 42-45°С в течение 5 мин, после чего продолжают ферментацию еще 2 ч при той же гемпературе.

После окончания процесса для определения активности интерферона клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием, осадок ресуспендируют в

1 мл 1 %-ного раствора додецилсульфата натрия в 0,02 М фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 1% 2-меркаптоэтанола, и прогревают 2-4 мин при 100°С. После этого осадок отбрасывают центрифугированием и активность интерферона, содержащегося в надосадочной фракции; определяют стандартными методами или по защите диплоидных фибробластов человека от цито- патического действия вируса везикулярного стоматита, или методами иммуноферментного анализа. В качестве стандартов используют препараты /J -интерферона (Тогеу, Япония), оттитрованные по стандарту лейкоцитарного интерферона МРСВ 69/19 (Великобритания) или Р9 (СССР).

По различным методам определения активность фибробластного интерферона человека, синтезируемого в клетках штамма E.coli ВНИИгенетика VL903 (pPR-lFNyS-13), составляет более 2-10 международных ед./л бактериальной культуры.

Для определения доли синтезированного фибробластного интерферона от суммарного клеточного белка клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием и обрабатывают указанным образом, препарат разделяют электрофорезом в присутствии 0,1 % додецилсульфата натрия в 15%-ном полиакриламидном геле. Белки, разделенные в полиакриламидном геле, прокрашивают в растворе Кумасси Р-250. Количественное содержание белков в зонах определяют после сканирования геля на автоматическом лазерном денситометре KB 2202 фирмы KB (Швеция). Идентификацию зоны, соответствующей синтезированному в клетках зрелому фибробластному интерферону (19 кД), проводят на основе сравнения с электрофоретической подвижностью маркерных белков, а также с помощью имму- ноблотинга разделенных белковых фракций на нитроцеллюлозные фильтры и идентификации зоны интерферона с помощью обработки фильтров в растворах, содержащих мышиные моноклинальные антитела против -интерферона и антимышиные кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой из хрена. После соответствующей процедуры окрашивания зона интерферона выглядит темной полосой коричневого цвета на неокрашенном фоне нитроцеллюлозного фильтра.

Содержание белка в зоне, соответствующей ft 1-интерферону. составляет около 10% от суммарного белка плазмидсодержа- щих клеток E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IFN/8l -13).

Таким образом, изобретение в условиях крупномасштабного культивирования клеток Escherichia coli позволяет достичь выхода более 2 х 109 ед./л, что соответствует 5-10% от общего клеточного белка.

Формула изобретения

1. Рекрмбинантная плазмидная ДНК pPR-IFN/ ИЗ, кодирующая синтез фибробластногоинтерферона/50)человека, длиной около 3,9 тыс.н.п., содержащая

BamHJ-BgLII-фрагмент векторной плаз- миды pPR 124 (размером 3,4 т.н.п.), модифицированный введением в ее состав

олигонуклеидного BgLII линкера, EcoRf- ЗапЗА-фрагмент длиной 510 н.п. плазмиды pJN/ -tvp7, который содержит участок, ответственный за инициацию репликации и ее регуляцию,- CoLEI-репликон (ovi CoLEI),

ген репрессора cltS 857 фага Я, , ген устойчивости к ампициллину (Арг), Тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd(tfd),

регуляторную область (РкОк),

SD-последовательность гена его (SDcro), кодирующую последовательность зрелого фибробластного интерферона человека (TFN/J I) с собственным метиониновым кодоном (f-Met),

соединение регуляторной области гена его А, кодирующей части / 1-интерферона и терминаторов транскрипции fd, которое осуществлено так, что перед геном JFN/JI образован гибридный участок связывания рибосом, имеющий следующую нук- леотидную последовательность: 5 -... TAAGGAGGTTGGATG... -3 , где TAAGGAGGT - SD-последовательность гена его фага, АТС - метиониновый кодон интерферона, а непосредственно за терминирующим кодоном гена iFN /3 расположен тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd,

уникальные участки узнавания рестриктаз cLal, координата которого является началом отсчета (0), Pvui (1110), BgLII (-1480). АсеТН870), Pvul (J360).

2. Способ конструирования рекомби- нантной плазмиды pPR-lFN/3 T-13, заключающийся в том. что в состав pPR 124 с помощью олигонуклеотидного линкера вводят уникальный участок узнавания рестрик- тазы BgLII. в результате получают плазмиду pPR124B, которую затем расщепляют рестрикционными эндонуклеазами EcoRl и BgLII, проводят соединение большего из образующихся фрагментов векторной молекулы с EcoR -Sau3A фрагментом плазмиды pJN ft -trp7, содержащим кодирующую

часть зрелого j-интерферона, в полученной таким образом рекомбинантной плаз- миде проводят сближение SD-последо- вательности гена его и первого (метионино- вого) кодона ft -интерферона. для чего плазмидную ДНК гидролизуют рестрикта- зой BamHI, удаляют часть нуклеотидов с помощью экзонуклеазной активности ДНК- полимеразы I, проявляющейся в условиях неполного набора нуклеозидтрифосфатов в реакционной смеси, ферментативно расщепляют ДНК рестриктазой EcoR l. обрабатывают Sl-эндонуклеазой для удаления одноцепочечных участков ДН К и последующего полного восстановления двуцепо- чечных концов с помощью Кленовского

фрагмента ДНК-полимеразы E.coli и обеспечивают циклизацию образующихся линейных молекул ДНК ДНК-лигазой фага Т4, полученным таким образом препаратом трансформируют клетки E.coli C600 с отбором трансформантов на среде с ампицилли- ном при культивировании клеток при 28°С с последующей селекцией клонов, обладающих пониженной скоростью роста при 42°С, после чего из отобранных клонов выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК pPRHFN /SI-13.

3. Штамм бактерий Escherichia coli ВНИИА 1825 - продуцент фиброблэстно- го (/ I) интерферона человека.

0

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности. Цель - повышение уровня фибробластного интерферона (б 1) человека в клетках штамма-продуцента. Сконструирована рекомби- нантная плазмида pPR-IFN/3 1-13, которая обеспечивает регулируемый синтез фибробластного интерферона человека в клетках E.coli под контролем промоторно-оператор- ной области PRORбактериофага А. С помощью плазмиды pPR-lFN / 1-13 получен штамм E.coli ВНИИГенетика vl.903 (pPR-IP№1-13), продуцирующий фибробластный интерфе- рон в количестве 2 -109 международных ед. интерферона на 1 л бактериальной культуры, что составляет около 10% от суммарного клеточного белка. 3 с.п. ф-лы. (/)