СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА-2 Российский патент 1998 года по МПК C12N15/21 C12P21/00 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к производству рекомбинантного интерферона-альфа-2 человека в промышленном масштабе.

Интерферон-альфа-2 является одним из основных компонентов лейкоцитарного интерферона человека и известен своими противовирусными и противоопухолевыми свойствами.

Известен способ промышленного получения природного лейкоцитарного интерферона, основанный на использовании лейкоцитов донорской крови, индуцированных вирусом [1]. Низкий выход продукта, высокая стоимость сырья и ограниченность его источников определяют высокую стоимость препарата, получаемого этим способом, и накладывают ограничения на возможность его производства в количествах, необходимых для медицины и научных исследований. Поэтому в течение последних 15 лет в ведущих странах мира проводятся исследования по получению человеческого лейкоцитарного интерферона микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов.

Известен способ получения альфа-интерферона с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli 294/pLelFA (ATCC 31446) с плазмидой, содержащей структурный ген человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа A (патент США N 4656131) [2]. Способ заключается в том, что в 5-литровом ферментере выращивают биомассу E.coli 294 на химически определенной среде. Используют стандартную среду М-9, обогащенную добавлением глюкозы, L-глутамата натрия, хлорида железа шестиводного, сульфата меди пятиводного, сульфата цинка, витамина B1, тетрациклина гидрохлорида, L-пролина и L-лейцина. Культивирование ведут при перемешивании 1000 об/мин, аэрации 1 л/л питательной среды в мин и при температуре 37^oC, в ходе процесса температуру ступенчато понижают до 25^oC в зависимости от оптической плотности культуральной жидкости. В течение культивирования добавляют глюкозу по мере ее потребления до исходного уровня 25 г/л, что обеспечивает уровень биосинтеза интерферона около 3,2•10⁷ ед. активности на мл культуральной жидкости.

Недостатками известного способа являются:
описанная технология получения интерферона-альфа A человека микробиологическим синтезом осуществлена на лабораторном оборудовании; прямой перенос результатов от лабораторной установки к промышленному аппарату неочевиден, так как методы теории подобия, позволяющие получать критерии масштабирования, в биотехнологии, так же как и в химической технологии, непригодны [3];
при выращивании используют многокомпонентную дорогостоящую питательную среду, содержащую очищенные аминокислоты и витамин B1;
для достижения высокого выхода целевого продукта используют дробное многократное добавление раствора глюкозы, что усложняет технологический процесс;
используемый штамм недоступен российским производителям.

Известен штамм-продуцент полипептида с биологической активностью лейкоцитарного интерферона-альфа-2 человека E.coli SG20050/plF14. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте в LB среде образуют интенсивную ровную муть. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (до 500 мкг/мл) благодаря наличию транспозона [4]. Штамм-продуцент E.coli SG20050/plF14 обуславливает конститутивный синтез полипептида со свойствами интерферона-альфа-2 человека на уровне 1,2-2,5•10⁷ ME/мл клеточной суспензии, что составляет более 35% суммарного клеточного белка бактерий.

По используемой питательной среде, условиям культивирования, принципу конструирования плазмиды и достигаемому результату штамм E.coli SG20050/plF14 наиболее близок к штамму E.coli SG20050/plF16, использованному в заявленном техническом решении. Преимуществом штамма-продуцента E.coli SG20050/plF16 является более высокий уровень биосинтеза интерферона, который достигает 3-5•10⁷ ME/мл клеточной суспензии, что составляет более 50 % суммарного белка бактерий.

Штамм разработан Всесоюзным научно-исследовательским институтом молекулярной биологии НПО "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") и является объектом защиты по патенту РФ N 2054041 [5].

Технология крупномасштабного культивирования не является объектом изобретений, защищенных авторским свидетельством СССР 1703691 и патентом РФ N 2054041 [4, 5] . В известных решениях описаны конструкции соответствующих плазмид, способы их конструирования и штаммы-продуценты полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона-альфа-2 человека.

Известен способ получения интерферона-альфа-2 с использованием рекомбинантного штамма Pseudomonas sp. VG-84 в ферментере с рабочим объемом 10 л [6, прототип]. Способ заключается в том, что рекомбинантные бактерии Pseudomonas species культивируют на питательной среде, содержащей гидролизат пекарских дрожжей, D-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при температуре 30±0,5^oC, pH 7,0±0,1. Каждые полчаса измеряют оптическую плотность культуральной жидкости и определяют скорость роста бактерий, с ростом величины оптической плотности увеличивают парциальное давление кислорода от 40% от насыщения при 2,5-3,0 опт.ед. до 70% от насыщения при 6,5-7,0 опт. ед. и через 15-30 мин после достижения бактериями максимальной скорости роста температуру среды понижают от 30±0,5^oC до 20±0,5^oC. Процесс завершают через 2,5±0,5 ч после снижения температуры, что позволяет стабилизировать и повысить выход альфа-2-интерферона. Необходимое парциальное давление кислорода поддерживают, меняя расход воздуха, водородный показатель регулируют подачей либо 40%-ного раствора гидроокиси натрия, либо 35%-ного раствора фосфорной кислоты. Достигаемая продуктивность по альфа-2-интерферону составляет 2,6•10⁶ МЕ/мл культуральной жидкости.

Недостатками известного способа являются:
необходимость в тщательном контроле и регулировании условий культивирования: температуры, pH, парциального давления кислорода, оптической плотности среды;
выход целевого белка составляет не более 2,6•10⁶ МЕ/мл культуральной жидкости, что на порядок ниже выхода, достигаемого при культивировании E.coli SG 20050/plF16 на лабораторном оборудовании;
при культивировании на одном и том же промышленном оборудовании выход целевого белка также на порядок ниже выхода достигаемого при культивировании E.coli SG 20050/plF16 (таблица 4 );
более высокая по сравнению с культивированием E.coli SG20050 plF/16 стоимость питательной среды;
более высокие энергетические затраты, необходимые для интенсивной аэрации и интенсивного перемешивания культуральной жидкости.

Задачей изобретения является разработка технологии крупномасштабного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2 при культивировании рекомбинантного штамма-продуцента, обеспечивающей оптимальные условия культивирования и, как следствие, максимальное накопление альфа-2-интерферона в клетках бактерий при одновременном снижении энергетических затрат и трудоемкости процесса.

Поставленная задача решается тем, что в способе промышленного получения интерферона-альфа-2 человека путем глубинного культивирования рекомбинантного штамма-продуцента на стандартной LB среде при исходном значении pH 7,0-7,2 и температуре 30±1^oC согласно изобретению используют штамм-продуцент E.coli SG20050/plF16, выращивание ведут в присутствии ампициллина и тетрациклина при скорости вращения перемешивающего устройства 12-15 об/мин и интенсивности аэрации 0,5±0,8 л/л•ч.

Способ осуществляют следующим образом:
Готовят LB среду с антибиотиками на водопроводной воде, очищенной от механических и органических примесей методом ультрафильтрации на аппаратах разделительных с диаметром пор 5 мкм (например, ультрафильтрационный аппарат НПО "Химволокно"). Стерилизуют питательную среду известным методом стерилизующей фильтрации (например, используя патронные фильтры фирмы "Millipor" или "Владисарт").

Лабораторный ферментер объемом 5 л со стерильной LB средой с антибиотиками засевают клетками E.coli SG 20050/plF16. Объем питательной среды 3,0 л. Для засева ферментера используют колонии, выращенные на агаризованной LB среде, суспендированные в 50 мл питательного бульона. Культивирование ведут в течение 16-24 ч при постоянном перемешивании со скоростью 100 об/мин и аэрации из расчета 0,5 л сжатого воздуха на литр культуральной жидкости в час. Начальное значение pH среды 7,0-7,2. В процессе культивирования значение pH не регулируют.

Выращенным инокулятом засевают промышленный ферментер вместимостью 250 л и культивируют при следующих условиях: обьем питательной среды 100 л; температура 30±1^oC; начальное значение pH 7,0-7,2; подача воздуха ведется из расчета 0,5-0,8 л/ч на литр культуральной жидкости; скорость вращения перемешивающего устройства 12-15 об/мин.

Сразу после засева и далее каждые 4 ч отбирают пробу культуральной жидкости и анализируют по следующим параметрам: величина оптической плотности, стерильность суспензии, pH.

Процесс заканчивают при достижении величины оптической плотности не менее 1 OE.

Накопление полипептида со свойствами интерферона-альфа-2 человека составляет при этом (2,4-4,1) • 10⁷ ME/мл питательной среды.

Способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выбор оптимальной температуры культивирования.

Культивирование в ферментере вместимостью 250 л проводят при различных значениях температуры, при неизменной скорости вращения перемешивающего устройства и постоянной скорости аэрирования. Объем питательной среды 100 л, перемешивание 15 об/мин, аэрация 0,5 л/ч на литр культуральной среды. Результаты экспериментов указаны в таблице 1.

Таким образом видно, что максимальное накопление целевого белка идет при температуре 30±1^oC, снижение температуры культивирования до 25±1^oC ведет к значительному увеличению времени культивирования и к снижению продуктивности, повышение температуры до 37±1^oC ведет к резкому снижению продуктивности культуры по целевому белку.

Пример 2. Поиск оптимальной скорости перемешивания культуральной жидкости.

Культивирование в ферментере вместимостью 250 л проводят при разных скоростях вращения перемешивающего устройства и постоянных значениях температуры культивирования и интенсивности аэрации.

Объем питательной среды 100 л, температура культивирования 30±1^oC, подача воздуха 0,5 л/ч на литр культуральной среды. Результаты экспериментов приведены в таблице 2.

Таким образом видно, что максимальное накопление целевого белка идет при скорости вращения перемешивающего устройства 10-15 об/мин. Увеличение скорости вращения перемешивающего устройства до 50 об/мин ведет к значительному снижению выхода целевого продукта.

Пример 3. Поиск оптимальной интенсивности аэрации культуральной жидкости.

Культивирование в ферментере вместимостью 250 л проводят при различной интенсивности аэрации и неизменных значениях температуры культивирования и скорости вращения перемешивающего устройства.

Объем питательной среды 100 л, температура культивирования 30±1^oC, скорость вращения перемешивающего устройства 15 об/мин.

Результаты экспериментов приведены в таблице 3.

Из экспериментальных данных видно, что максимальное накопление целевого белка идет при аэрации 0,5-1,0 л/л культуральной среды в час, снижение интенсивности аэрации до 0,1 л/л•ч и увеличение интенсивности аэрации до 2,5 л/л•ч ведет к резкому снижению выхода целевого продукта.

Таким образом, промышленный способ получения лейкоцитарного интерферона-альфа-2 человека с использованием штамма Escherichia coli SG 20050/plF 16 позволяет получить более высокий - в 10 раз - выход целевого белка при меньших материальных и энергетических затратах, чем при культивировании рекомбинантных бактерий Pseudomonas sp.

Пример 4. Культивирование в аппарате вместимостью 630 л.

Культивирование в ферментере вместимостью 630 л проводят при условиях, найденных оптимальными для ферментера вместимостью 250 л: температура культивирования 30±1^oC, скорость вращения перемешивающего устройства 15 об/мин, интенсивность аэрации 0,5 л/л культуральной среды в час, начальное значение pH 7,0-7,2, объем культуральной среды 300 л.

Питательную среду засевают инокулятом, выращенным, как для ферментера вместимостью 250 л, в лабораторном ферментере вместимостью 10 л. Объем инокулята 8,0 л. Сразу после засева и далее каждые 4 ч отбирают пробу культуральной жидкости и анализируют по следующим параметрам: величина оптической плотности, стерильность суспензии, pH. Процесс заканчивают при достижении величины оптической плотности не менее 1 OE. Накопление полипептида со свойствами интерферона альфа-2 человека составляет при этом 0,6-0,8•10⁷ ME/мл культуральной жидкости (по данным четырех независимых экспериментов для данного типа ферментера).

Цитируемая литература
1. Human lymphoblastoid interferon. Large scale production and partial purification.//Bridgen P.J. et al. J.Biol.Chem. 1977, p. 6885-6887.

2. Патент США N 4656131. Method for producing interferons. МКИ C 12 P 21/00, НКИ 435/68.

3. Аэрация и перемешивание в процессах культивирования микроорганизмов. Обзор. Бирюков В.В. Кузьмина Л.М., М. 1984, ВНИИСЭНТИ.

4. Авторское свидетельство СССР N 1703691. C 12 N 15/21. Рекомбинантная плазмидная ДНК plF14, кодирующая полипептид со свойствами лейкоцитарного интерферона-альфа-2 человека, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона-альфа-2 человека.

5. Патент РФ N 2054041. C 12 N 15/21. Рекомбинантная плазмидная ДНК plF16, кодирующая зрелый лейкоцитарный интерферон альфа-2 человека, штамм E. coli - продуцент зрелого интерферона альфа-2 человека.

6. Авторское свидетельство СССР 1712416. C 12 N 15/00. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas species.

Способ может быть использован для производства рекомбинантного интерферона-альфа-2 человека в промышленном масштабе. Штамм Esoherichia coli SG 20050/pIF выращивают в LB - среде при скорости вращения перемещивающего устройства 12-15 об/мин и интенсивности аэрации 0,5-0,8 л/л•ч. Накопление полипептида составляет (2,4-4,1) •10⁷ МЕ/мл. 4 табл.

\ \\1 Способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, включающий глубинное культивирование рекомбинантных бактерий в питательной среде при температуре 30 <$E+-> 1<198>C и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют рекомбинантный штамм Escherichia coli SG 20050/pIF 16, культивирование проводят в питательной среде, содержащей ампициллин и тетрациклин, при скорости вращения перемешивающего устройства 12 - 15 об/мин и интенсивности аэрации 0,5 - 0,8 л/л <195> ч.