РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pTrcIFdL, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД С АКТИВНОСТЬЮ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА С АКТИВНОСТЬЮ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК C12N15/00 C12N15/23 C12N15/70 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для получения гамма-интерферона (иммунного интерферона) человека.

Гамма-интерферон человека (ИФН-гамма) - гликопротеин, продуцируемый специализированными клетками в ответ на действие вирусов и других индукторов. Он обладает широким спектром биологической активности, включая антивирусную активность против ряда вирусов, активацию естественных киллеров, ингибирование роста клеток, противоопухолевое действие [Dijkmans R., Billiau A. Interferon gamma: A master key in the immune system. Curr. Opin. Immunol. 1988. V.1., P.269-274]. Использование гамма-интерферона как лекарственного препарата имеет большие перспективы при лечении вирусных и некоторых онкологических заболеваний, в связи с этим получение рекомбинантного белка и эффективных штаммов-продуцентов является актуальной задачей биотехнологии.

Зрелый гамма-интерферон человека представляет собой полипептид длиной 143 аминокислотных остатка и не содержит остатков цистеина [Rinderkneht E., О'Connor B.H., Rodriguez H. Natural human interferon-gamma: Complele amino asids sequence and determination of sites of glycosilation. J. Biol. Chem. 1984. V.259. P.6790-6797]. Биологически активной формой ИФН-гамма является нековалентно связанный димер, тепловая денатурация которого происходит при 52°C и сопровождается инактивацией и необратимым агрегированием. C-концевые остатки не участвуют в образовании третичной структуры белка и их делеция вплоть до 20 аминокислот не приводит к потере биологической активности [Slodowski О., Bohm J., Schone В., Otto В. Carboxy-terminal truncated rhuIFN-g with a substitution of Gln 133 or Ser 132 to leucine leads to higher biological activity than in the wild type. Eur. J. Biochem. 1991. V.202. P.1133-1140].

Известен способ получения гамма-интерферона из компонентов человеческой крови [Braude I. Purification of natural human immune interferon induced by A-23187 and mazerin. Methods of enzymology. 1986. V.119. P.193-199], недостатком этого способа является низкий (менее 1 мг/л донорской крови) выход целевого продукта.

Известен способ получения вариантов полипептида с активностью гамма-интерферона в результате экспрессии в клетках млекопитающих [патент РФ 2296130, опубл. 2002 г.].

Недостатками способа являются высокая цена на компоненты питательных сред для эукариот и необходимость дорогостоящих стадий очистки.

Известны плазмидные конструкции и созданные на их основе штаммы E.coli, продуцирующие с довольно высоким выходом ИФН-гамма человека [Ovchinnikov Y.A., Sverdlov E.D., Tzarev S.A., Arsenian S.G., Monastirskaya G.S., Krykbaev R.A., Rostapshov V.M., Chestukhin A.V., Melkov A.M., Vinogradova T.V., Tchernov I.P., Kuznetzov V.P., Novohvatskiy A.S., Ershov F.I., Aspetov R.D. Recombibant plasmid DNA encoding synthesis of human immune interferon. Invent. Bull. 1990. V.34. P.276.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения ИФН-гамма человека микробиологическим синтезом в клетках E.coli [патент РФ №2105813, МКИ, опубл. 1998]. Штамм E.coli MH-1 содержит рекомбинантную плазмидную ДНК PIF Δ10, кодирующую человеческий гамма-интерферон с делецией 10 C-концевых остатков, экспрессия которого находится под контролем тандема триптофановых промоторов.

К недостаткам способа можно отнести термочувствительность получаемого полипептида, свойственную и природному ИФН-гамма, а также высокий базальный уровень синтеза белка в системах экспрессии на основе триптофанового промотора.

Технической задачей изобретения является создание штамма-продуцента с высоким индуцибельным уровнем биосинтеза полипептида с биологической активностью гамма-интерферона человека и повышенной термоустойчивостью.

Поставленная задача решается за счет рекомбинантной плазмидной ДНК pTrcIFdL, кодирующей полипептид с активностью гамма-интерферона человека с мол. массой 3,06 Md (4,642 т.п.о.), состоящей из ClaI/HindIII - фрагмента ДНК плазмиды pTrcTEGF длиной 4,232 т.п.о., включающего trc-промотор E.coli, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, терминатор транскрипции фага лямбда, ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pTrcIFdL клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации; фрагмента ДНК плазмиды pGFIFΔw размером 0,402 т.п.о., содержащего ген Ifg, кодирующий аминокислотную последовательность гамма-интерферона человека с делецией 10 C-концевых аминокислот и заменой Gln в положении 134 на Leu и фланкированного сайтами рестрикции ClaI и HindIII; содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: EcoRI - 270, Kpn I - 286, Cla I - 377; HindIII - 787, XbaI - 340, а также за счет штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pTrcIFdL - продуцента полипептида с активностью гамма-интерферона человека.

Особенностью предложенной плазмидной конструкции является то, что делеционный вариант гена гамма-интерферона человека (SEQ ID NO 1) находится под контролем сильного trc-промотора E.coli, а для усиления трансляции используется синтетический усилитель трансляции (TREN) гена 10 бактериофага Т7, что в совокупности обеспечивает индуцибельный синтез целевого белка (SEQ ID NO 2) с надежной регуляцией и высоким выходом, достигаемым при малых концентрациях индуктора.

Для получения штамма-продуцента полипептида с биологической активностью гамма-интерферона человека компетентные клетки Escherichia coli штамма BL21(DE3) трансформируют рекомбинантной плазмидой pTrcIFdL.

Полученный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pTrcIFdL характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, подвижные, размером 1×3-5 мкм, неспороносные.

Кулътуралъные признаки: при росте на агаризованной LB-среде преобладают мелкие колонии диаметром 1-3 мм; круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный; консистенция пастообразная. Могут встречаться крупные колонии диаметром 4-5 мм; круглые, гладкие, матовые, край волнистый. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется равномерным помутнением среды.

Физиолого-биохимические признаки. Клетки штамма продуцента могут расти в диапазоне температур 20-42°C, оптимальная температура роста составляет 37°C. Наиболее благоприятные для роста значения рН находятся в интервале 6,8-7,2. При росте в аэробных условиях культура может усваивать азот как органических соединений (пептон, триптон, аминокислоты, дрожжевой экстракт), так и аммонийных солей. Углерод усваивается в форме углеводов, многоатомных спиртов (глицерин), аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы.

Способ, условия и состав среды для хранения штамма. LB-бульон с 15% глицерином, при температуре - 70°C, в криовиалах.

Технический результат заявленного изобретения заключается в том, что полученный штамм позволяет эффективно получать более термостабильный и биологически активный по сравнению с прототипом полипептид с активностью гамма-интерферона человека. Штамм E.coli BL21(DE3)/pTrcIFdL обеспечивает устойчивый индуцибельный синтез полипептида гамма-интерферона человека в количестве не менее 40% от суммарного клеточного белка, что обуславливает высокую технологичность процесса выделения и очистки рекомбинантного белка.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.

Фиг.1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pTrcIFdL. Указаны уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции. Ptrc - промотор транскрипции, bla - ген β-лактамазы, Ifg - мутантный ген бета-интерферона человека с введенной делецией 10 C-концевых аминокислот и заменой Gln в положении 134 на Leu, ColE1 ori - участок инициации репликации плазмиды, Tren - синтетический усилитель трансляции гена 10 бактериофага Т7.

Фиг.2. Электрофореграмма лизатов клеток штамма-продуцента E.coli BL21(DE3)/pTrcIFdL до (дорожка 2) и после индукции (дорожки 1 и 3) в 13,5%-ном полиакриламидном геле (М - белковые маркеры молекулярной массы); стрелкой указан полипептид ИФН-гамма

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1

Конструирование экспрессионной плазмиды pTrcIFdL. 10 мкг плазмиды pTrcTEG [Л.Н.Шингарова, С.К.Кашьяп, Л.Е.Петровская и др. «Экспрессия гена гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в Escherich coli» Биотехнология. 1998. №6. С.24-35] обрабатывают рестриктазами ClaI и HindIII по стандартной методике [Sambrook J., Fritsc E., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989]. Линеаризированную векторную часть длиной 4232 п.о., содержащую усилитель трансляции TREN, выделяют из агарозного геля. Далее 10 мкг плазмиды pGFIFΔ10w, кодирующей гамма-интерферон человека с делецией 10 C-концевых аминокислот и заменой Gln в положении 134 на Leu [Pechenov S.E., Tikhonov R.V., Shingarova L.N., Korobko V.G «Methods of preparation of recombinant cytokine proteins V. Mutant analogues of human interferon-γ with higher stability and activity. Protein Expr. Purif. 2002. V.24. P.173-180] обрабатывают рестриктазами ClaI и HindIII, фрагмент длиной 0,402 т.п.о выделяют из агарозного геля. 3 мкг полученного ClaI-HindIII - фрагмента и 1 мкг линеаризированной векторной части лигируют в 20 мкл реакционной смеси по стандартной методике. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Скрининг клонов проводят рестриктным анализом ClaI, NdeI и HindIII. Полученную плазмиду pTrcIFdL, содержащую усилитель трансляции TREN и мутантный ген, кодирующий ИФ-гамма, анализируют рестриктазами НаеIII, Kpn I и HindIII. Структуру клонированного мутантного гена в отобранных клонах подтверждают определением нуклеотидной последовательности. В результате получают экспрессионную плазмиду pTrcIFdL (фиг.1).

Пример 2

Получение штамма-продуцента полипептида гамма-интерферона человека.

Рекомбинантной плазмидной ДНК pTrcIFdL трансформируют компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen) и после выращивания рекомбинантных клонов на LB-агаре с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°C получают штамм-продуцент полипептида гамма-интерферона человека.

Пример 3

Определение продуктивности штамма-продуцента полипептида гамма-интерферона человека

Для определения продуктивности штамма E.coli BL21(DE3)/pTrcIFdL ночную культуру в объеме 200 мкл переносят в 10 мл жидкой среды LB (разбавление до оптической плотности 0.15-0.18 при длине волны 560 нм), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивают до оптической плотности 0,8 (длина волны 560 нм) при 37°C и перемешивании 200 об/мин. Индукцию синтеза интерферона-бета проводят 0,2 мМ ИПТГ, после чего клетки выращивают в течение 3 ч. Отбирают пробу культуры в количестве 1 оптическая единица (длина волны 560 нм) и центрифугируют 5 мин при скорости 6000 об/мин. Осажденные клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, инкубируют 10 мин в кипящей водяной бане, образцы объемом 10 мкл анализируют электрофорезом в 13,5% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. По окончании электрофореза гель прокрашивают при помощи кумасси R-250. После отмывки красителя гель сканируют и проводят математическую обработку результатов с помощью программы Scion Image (Scion Corp., США). По данным сканирования содержание полипептида гамма-интерферона составляет 40% от общего клеточного белка. На фиг.2 представлена электрофореграмма лизатов клеток штамма-реципиента E.coli BL21(DE3) (дорожка 2), штамма-продуцента E.coli BL21(DE3)/pTrcIFdL (дорожки 1 и 3) в 13,5%-ном полиакриламидном геле (М - белковые маркеры молекулярной массы; стрелкой указан полипептид ИФН-гамма).

Пример 4

Выделение и очистка рекомбинантного полипептида с биологической активностью гамма-интерферона человека.

Выделение и очистку ИФН-гамма проводят в соответствии с методом, описанным в работе [Вульфсон А.Н., Тихонов Р.В., Печенов С.Е и др., ж-л «Биоорган. Химия», 1997, т.23, с.721-726].

1 г влажной биомассы индуцированных клеток ресуспендируют в 10 мл буфера А (50 мМ фосфат натрия, рН 8.0, 2 мМ EDTA, 0,001% PMSF), добавляют раствор лизоцима до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубируют во льду 20 минут, после чего разрушают клетки обработкой в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т, не допуская нагрева выше 10°C. Полученную суспензию центрифугируют, осадок последовательно промывают буфером А (2 раза по 20 мл); буфером А, содержащим 1% Тритон Х-100 (2 раза по 20 мл); буферным раствором, содержащим 3М мочевину, 50 мМ фосфат натрия, рН 7.5 и 0,001% PMSF (4 раза по 20 мл); буферным раствором, содержащим 50 мМ фосфат натрия, рН 9.4 и 0,001% PMSF (2 раза по 20 мл). Осадок тел включения растворяют в 30 мл буфера В (40 мМ Na₂HPO₄, рН 9.4, 8 М мочевина 0,001% PMSF) в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Раствор центрифугируют, супернатант доводят до рН 6,2 и последовательно пропускают через колонку с Н-гамма-гелем (10 мл) и QAE-гамма-гелем (5 мл) для избавления от гидрофобных примесей и нуклеиновых кислот, после чего проводят хроматографию на колонке с SP-Toyopearl (10 мл) в градиенте концентрации ацетата аммония (0,05-0,5М) в 6 М мочевине, рН 6,2. Объединенные фракции, имеющие по данным белкового электрофореза чистоту более 90%, разбавляют в 7 раз (концентрация белка 0,1 мг/мл) и ренатурируют в течение 4 ч при 3°C и перемешивании. Ренатурированный продукт очищают хроматографией на колонке с SP-Toyopearl (10 мл) в линейном градиенте концентрации NaCl (0-0,8М) в буфере С (20 мМ Трис-HCl, рН 7,2). Фракции, содержащие очищенный белок, диализуют против буфера С и стерилизуют. Средний выход очищенного таким образом ИФН-гамма составляет 50 мг из 1 л культуры.

Пример 5

Определение физико-химических и биологических свойств полипептида ИФН-гамма.

Анализ вторичной структуры полипептида ИФН-гамма осуществляют методом кругового дихроизма на приборе J500C фирмы JASCO (Япония). По данным анализа 62% аминокислотных остатков входят в состав α-спиральных участков, а CD-спектр рекомбинантного белка полностью совпадает со спектром природного ИФН-гамма. Термоустойчивость полипептида ИФН-гамма определяют измерением температуры плавления, как описано в работе [Pechenov S.E., Tikhonov R.V., Shingarova L.N. at al., Methods of preparation of recombinant cytokine proteins V. Mutant analogues of human interferon-γ with higher stability and activity. Protein Expr. Purif. 2002. V.24. P.173-180]. По полученным данным T_плавл. целевого полипептида составляет 57°C против 52°C для природного белка.

Биологическую активность определяют в тесте по супрессии цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на диплоидные фибробласты человека [Krispin T.I., Parfenova T.M., Itkes A.V. et al. Antiviral activity of lambda-, beta-, and gamma-interferons in the presens of theophyllin: Involvment of 2,3-ologo(A) synthetase. Biochem. Int. 1984. V.8. P.159-164]. По данным анализа препарат полипептида ИФН-гамма обладает антивирусной активностью 7,2×10⁷ ед./мг, что выше, чем активность белка дикого типа (2,2×10⁷ ед./мг).

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить полипептид со структурой и свойствами, идентичными структуре и свойствам природного интерферона-гамма человека, при этом делеция 10 C-концевых аминокислот и замена Gln в положении 134 на Leu увеличивает термоустойчивость рекомбинантного белка на 5°C при повышении биологической активности. Биосинтез полипептида индуцибелен, уровень его биосинтеза составляет до 40% от суммарного клеточного белка за счет использования синтетического усилителя трансляции (TREN). Все это позволяет технологически эффективно получать более термостабильный и биологически активный по сравнению с прототипом полипептид с активностью гамма-интерферона человека.

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для получения гамма-интерферона человека. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrcIFdL, кодирующую полипептид с активностью гамма-интерферона человека мол. массой 3,06 Md (4,642 т.п.о.) и имеющую физическую карту, приведенную на фиг.1. С помощью плазмидной ДНК pTrcIFdL получают штамм BL21(DE3)/pTrcIFdL - продуцент полипептида с активностью гамма-интерферона человека. Изобретение позволяет получить полипептид с биологической активностью гамма-интерферона человека и повышенной термоустойчивостью, а также увеличить уровень его биосинтеза до 40% от суммарного клеточного белка. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcIFdL, кодирующая полипептид с активностью гамма-интерферона человека с мол. массой 3,06 Md (4,642 т.п.о.), состоящая из ClaI/HindIII-фрагмента ДНК плазмиды pTrcTEGF длиной 4,232 т.п.о., включающего trc-промотор E.coli, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, терминатор транскрипции фага лямбда, ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pTrcIFdL клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации; фрагмента ДНК плазмиды pGFIFΔw размером 0,402 т.п.о., содержащего ген Ifg, кодирующий аминокислотную последовательность гамма-интерферона человека с делецией 10 С-концевых аминокислот и заменой Gln в положении 134 на Leu и фланкированного сайтами рестрикции ClaI и HindIII; содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: EcoRI - 270, Kpn I -286, Cla I - 377; HindIII - 787, XbaI - 340.

2. Штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pTrcIFdL - продуцент полипептида с активностью гамма-интерферона человека.