Способ прогнозирования эмбиотропной активности производных бензимидазола Советский патент 1992 года по МПК G01N33/80 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии.

. Цель изобретения - сокращение сроков определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Небеременной беспородной или линейной крысе (Вистар,ВАГ, Август . и т.п.) вводят испытуемый препарат из группы бензимидаэолов в 3 раза увеличенной терапевтической дозе в ви-- де суспензии с добавлением нескольких капель Твина-80 в качестве эмульгатора. Суспензию вводят перорально через желудочный зонд. Три крысы препаратов не получают и служат контролем. Через 3-4 ч после введения испытуемого соединения огалтгых и контрольных крыс уСивсГ.от де капитан; .ей. Извлекают большую берцовую кость из каждой задней конечности; если между убоем и извлечением красного костного мозга имсется интервал, то кости заворачивают в мокрую марлю. Костный мозг быстро вымывают в центриЛужную .пробирку с 3 мл гипотонического раствора хлористого калия (0,555%). Центрифужные пробирки с гипотоническим раствором предварительно подогревают до 37 С. Пробирки с костным мозгом помещают в термостат при 37 С на 6-9 мин. Затем центрифугируют при 1000 об/мин (не больше) в течение 5 мин. Надоса доч нуга жидкость сливают и к осадку добавляют I мл свежеприготовленного фиксатора (3 части метабола и 1 часть ледя- нрй уксусной кислоты) и оставляют на 1-2 мин. Фиксатор сливает., добавляют 1-2 мд свежей порции фиксатора и оставляют на 7 мин, затем фиксатор снова с.ттнуп .ст, осадок осторо: лю разбивают постукнззаннем иальпа о npori;ip;:y, добавляют 0,5 мл фиксатора и станят в холодильник на 30 мин.

От 4

С7

Ч

- 170

а чистые пиджине охлажденные стек- па раскапывают полученные суспензии клеток, сушат над пламенем горелки. Препараты окрашивают азур-эозином (10%-ный водный растор).

На каждое химическое соединение готовят по 10 стекол: аналогично 10 сте- ,кол готовят и для контрольных крыс.

ки. Препараты окрашивают лзуи-гюзшюм (10%-Hbrii водный раствор).

Описанным способом готовят 10 стекол с суспензией клеток от крыс, которым ввели оксфендазол, и 10 - от контрольных животных.

Под световым микроскопом (х20) в 10 попях зрения на каждом стекле

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии. Цель - сокращение срока определения. С той; целью исследуют клетки красного костного мозга, определяют число метафг з и митотический индекс через 3-4 ч после введения исследуемого вещестга. В случае, если указанные показатели увеличиваются по сравнению с контролем на 10% и более, определяют эмбутю- тропную активность исследуемого препарата. Применение способа позтзоляет сократить срок определения эмбрнотроп-. ной активности производных бензимнда- зола с 1,5 месяцев до 2-3 дней по сравнению с прототипом.

Под световым микроскопом (х20) подсчи-,,. подсчитывают число клеток, находящихтывают число клеток, находящихся на стадиях про-, ана-, мета- и телофазы и в интерфазе, в 10 полях зрения на каждом1 стекле. Подсчитывают общее число делящихся и интерфазных клеток, j определяют процентное содержание клеток, находящихся на различных стадиях митоза:

Определяют митотический индекс.

ся на стадиях про-, ана-, мета- и телофазы и в интерфазе. Подсчитывают общее число -делящихся и интерфазных . клеток, определяют процентное содержание клеток, находящихся на различных стадиях митоза, и митотический индекс.. Пяти другим белым беспородным крысам массой 220-240 г на 9-й и 13-й

В случае, если эти показатели уве- 2Q дни беременности вводят оксфендазол

в дозе 30 мг/кг в виде водной суспен зии с добавлением Твина-80 в качестве эмульгатора через рот с помощью желудочного зонда. Предварительный отбор беременных самок проводят следующим образом: к самкам, находящимся в стадии экструса и проэуструса, вечером подсаживали самцов в соотношении 4:1, наутро просматривали влагалищные мазки, при обнаружении в ни сперматозоидов считали первым днем беременности.

личиваются по сравнению с контролем на 10% и более определяют эмбриотроп- ную активность исследуемого препарата Пример 1. Трем белым беспородным небеременным крысам массой 220- 240 г пероралъно через желудочный зонд вводят оксфендазол в дозе 30 мг/л (в 3 раза повышенная терапевтическая доза) в виде водной суспензии с добавлением в качестве эмульгатора Тви- на-80. Три крысы препарата не получают и служат контролем. Через 3 ч после введения препарата опытных и кЬнт- рольных животных одновременно убивают Из обеих задних конечностей извлекают большие берцовые кости и заворачивают их в кусочки мокрой марли. Костный мозг, вымывают в центрифужную пробирку с 3 мл гипотонического раствора хлористого калия (0,555%), центрифужиые пробирки предварительно подогревают до 37°С. Пробирки с костным мозгом помещают в термостат при 37 С на 6- .9 мин, затем центрифугируют при

1000 об/мин, в течение 5 мин. Надоса

дочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1 мл свежеприготовленного фиксатора (3 части метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты), оставляют на. 1-2 мин. Фиксатор сливают и добав ляют 1-2 мл новой порции фиксатора, оставляют на 7 мня, затем вновь сливают. Осадок осторожно разбивают постукиванием пальца о пробирку, добавляют 0,5 мл фиксатора и ставят- в холодильнлк аа 30 млн.

Полученную суспензию клеток раскапывают на чистые, влажные и охлажденные стекла, сутаат над пламенем горелся на стадиях про-, ана-, мета- и телофазы и в интерфазе. Подсчитывают общее число -делящихся и интерфазных . клеток, определяют процентное содержание клеток, находящихся на различных стадиях митоза, и митотический индекс.. Пяти другим белым беспородным крысам массой 220-240 г на 9-й и 13-й

дни беременности вводят оксфендазол

о

5

0

в дозе 30 мг/кг в виде водной суспензии с добавлением Твина-80 в качестве эмульгатора через рот с помощью желудочного зонда. Предварительный отбор беременных самок проводят следующим образом: к самкам, находящимся в стадии экструса и проэуструса, вечером подсаживали самцов в соотношении 4:1, наутро просматривали влагалищные мазки, при обнаружении в них сперматозоидов считали первым днем беременности.

Результаты учитывают на 2Я-Й день беременности. Самок убивают декапита- цией, вскрывают брюшную полость и матку. Подсчитывают число ..желтых тел-( беременности в обоих яичниках, мест имплантации, число живых, мертвых и резорбированных плодов. Эмбрионы Тщательно осматривают, регистрируя наружные аномалии, взвешивают и измеряют краниокаудальные размеры. Определяют пред-, постэмбриональную, гибель, а также общую эмбриональную

смертность плодов.

Статистическую обработку полученных данных проводят по тесту Стью- -.. д&нта..

В результате оценки оксфендазола на антимитотическое действие установили,- что при его введении белым беспородным крысам в дозе 30 мг/кг процентное содержание про-, мета-, ана- и телофаз соответственно равнялось 8,5912,74, 72,У314,48, 11,47±3,18, 8,19+2,74% против аналогичных контрольна значений 5,55±,-Я,.5,00± i4,33, 12,50±3,30 и 6,9/1+2,54%. Значение митотического индекса в популяции

Соматических клеток красного костного мозга опытных крыс через 3 часа после введения оксфендазола равнялось 1,73± +.1,30 против 1,60+1,25 в контроле, то есть не превышает 10%.

При введении этого же препарата беременным крысам-самкам на 9-й день эмбриогенеза уродливые плоды отсутствовали. Показатели эмбрибтоксичес- кого эффекта равнялись: предимплан- тационная гибель 7,81+3,38; постим- плантационная гибель - 6,7812,60; общая эмбриональная смертность - 14,061 +4,38 против соответствующих контрольных значений: 4,,34, 10,001 t3,59 и 13,69+4,05%. Масса и размеры плодов от опытных самок равнялись 2,18+0,04 и 2,85+0,02 против контрольных значений 2,2410,03 г и 2,831 +0,02 см.

Таким образом, из приведенных выше ние клеток, находящихся на различных данных совершенно очевидно, что оке- стадиях митоза и митотическнй индекс, фендазол не обладает антимитотичес- .. В результате опенки албсндаяола на ким действием для популяции соматичес 25 антимитотическое действие установили, ких клеток красного костного мозга са- что при его введении крысам Bucvap в мок и ке оказывает отрицательного дозе 20 мг/кг процентное содержание влияния на эмбриональное развитие крыс про-, мета-, апя- it телофаз соответст- Между двумя этими активностями имеет- ренно равнялось 1,04±1,14, 91,66+ ся полная корреля.-,ая.30 13,.11, 4,12+1,95 и 4,16+2,24 против

Пример.. Трем белым беспород- аналогичных контрольных значений 6,);V ным небеременным крысам массой 220- ±2,40, 76,8214,24, 10,97±3,1- : и 6,091 240 г перорально через желудочный i2,40%. Значение митотического индек- зонд вводят албендазол в дозе 20 мг/кг са в популяции соматических клеток (в 3 раза повышенная терапевтическая j$ красного костного мозга опытных крыс доза) в водной суспензии с добав- .через 4 ч после введения албендазола . лением в качестве эмульгатора Тви- равнялось 2,23+1,66 против 1,45±1,20 на-80. Три крысы препарата не полу- в контроле, т.е. больше 10%. чали и служили контролем. Через 4ч после введения опытных и контрольных животных одновременно убивают.Из обеих задних конечностей извлекают .большие берцовые кости и заворачивают их в-кусочки мокрой марли. Костный мозг вымывают в центрифужную пробирку с 3 мл гипотонического раствора хлористого калия (9,555/0, центрифужные пробирки предварительно подогревают до 37°С. Пробирки с костным моягом помещают в термостат при 37°С на 6- 9 мин, затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надоса- дочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1 мл свежеприготовленного фик- саторя (3 части метанола и 1 часть $5 ледяной уксусной кислоты), оставляют на 1-2 мин. Фиксатор сливают и добавляют 1-2 мл новой порции фиксатора, оставляют на 7 мин, затем вновь елидо При введении этого же препарата беременным крысам-самкам на 9-й день эмбриогенеза уродливые плоды отсутствовали. Отмечался значительный эмбрио- токсический эффект: так, предимплан45 тационная гибель равнялась 4 ,91 ±-.. ,79, постимплантацнонная - 82,75+-э,00 и общая эмбриональная - 83,61+4,78 против контрольных значений 12,1, ±3,27, 7,92+2,70 и 19,1313,68%. Резко снизились масса и размеры плодов: 1,48+0,03 и 2,52iO,04 против -2,20+0,03 г и 2,85±0,02 см в контроле.

Таким образом, из приведенных выпе. данных совершенно очевидно, что албендазол обладая антимитотическим действием для чопуляту.н сомати - -CCMir.: клеток красного местного мозга е-....-;, проявляет сильное эмбриотоксг.ческо... действие, проявляющееся в значительном

50

ватт.Осадок осторожно разбивают по- ,:. стукиванием пальца о пробирку, доПлп- ляют 0,5 мл фиксатора и ставят в хплодилъник на 30 мин.

Полученную суспензию клеток рас- капьтают на чистые, влажные и охлаж- . денные стекла, сушат над пламенем горелки. Препараты окрашивают азур-эозином (10%-ный водный раствор).

Описанным способом готовят 10 стекол с суспензией клеток от крыс, которым ввели оксфендязол, и 1° - от контрольных животных.

Под световым микроскопом (хЛП) 14 в 10 нолях зрения на каждом стекле подсчитывают число клеток, паходятпих- ся на стадиях про-, ана-, мета- и то- яофазы и в интерфазе. Подсчитали об0 щее число делящихся и интерфагзных

клеток, определяли процентное содер а

аналогичных контрольных значений 6,);V ±2,40, 76,8214,24, 10,97±3,1- : и 6,091 i2,40%. Значение митотического индек- са в популяции соматических клеток $ красного костного мозга опытных крыс .через 4 ч после введения албендазола . равнялось 2,23+1,66 против 1,45±1,20 в контроле, т.е. больше 10%. 5

о При введении этого же препарата беременным крысам-самкам на 9-й день эмбриогенеза уродливые плоды отсутствовали. Отмечался значительный эмбрио- токсический эффект: так, предимплан5 тационная гибель равнялась 4 ,91 ±-.. ,79, постимплантацнонная - 82,75+-э,00 и общая эмбриональная - 83,61+4,78 против контрольных значений 12,1, ±3,27, 7,92+2,70 и 19,1313,68%. Резко снизились масса и размеры плодов: 1,48+0,03 и 2,52iO,04 против -2,20+0,03 г и 2,85±0,02 см в контроле.

Таким образом, из приведенных выпе. данных совершенно очевидно, что албендазол обладая антимитотическим действием для чопуляту.н сомати - -CCMir.: клеток красного местного мозга е-....-;, проявляет сильное эмбриотоксг.ческо... действие, проявляющееся в значительном

0

увеличении пост- и общей эмбриональной гибели. Между двумя этими активностями имеется полная .корреляция.

Применение способа позволяет сокра- - тить срок определения эмбриотропной активности производных бензимидазола с. 1,5 месяцев до 2-3 дней. Формула изобретения

Способ прогнозирования эмбриотропной активности производных бечзимида- зола, включающий введение исследуемо

8

го препарата экспериментальному животному, отличающийся тем, что, с целью сокращения срока определения, исследуют клетки красного костного мозга, определяют число метафаз и митотический индекс через 3-4 ч после введения исследуемого препарата и в случае, если указанные показатели увеличиваются по сравнению с контролем на 10% и более, прогнозируют эм- бриотропную активность исследуемого препарата-.